利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
; H% X% k, U, C, d0 ~# D0 f( i! c        BIX 与Bayk 的作用机制：3 J1 _* A9 y1 e2 k$ m8 g
   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，# w. q5 ]5 I9 X
/ P4 [* P, y1 u+ A# \8 }* f" p. @
    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。
; g# k2 D& J# I$ ]0 u       
+ }, j0 v6 Z& G( J% v) W- \        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
' b2 H5 d) h4 j0 \& G: O" S4 y4 I        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，6 ~* T: o, A  C8 r! l9 _2 Y
        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。' f( _' S, J, F
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
9 h. z; K- q6 P! |5 P. E8 Z" m       
( M. ~; @( G& @/ L' z        进一步确定其多能性# V4 y" A# w9 M, {! j$ h1 Z; F- }
        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。, i2 x3 k2 ]: _7 ]8 Y) t0 s1 F
        检测其多能性：
2 y( i% E8 R5 D6 K/ G1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.7 `1 d0 e& y) ?( R& ^
2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。
7 J" l3 S! ^( d! Z' b3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis2 [! L% J) _- E# f! l
4、分化潜能:* j: T/ g( `( e4 ]& }
      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
0 Z1 }, ~" U8 ?2 h( a      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

stonelee2050

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。

flydayzhu

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子1 T! L( O7 a" ~  g" Q5 j& }1 d1 x
7 X3 g' s! n: \9 ^! F
呵呵，那篇文章我也想要啊……

钻石星辰

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。
% x3 |* a2 `( c& U0 F7 f) M& c" h5 C. G. O" ?$ K$ |' K0 g0 ]
目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。6 Q8 }( E8 t- b2 q7 b
' s+ ^) z. L) l; Z, ?  y' s; o  W
现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子
2 d; E1 M; N7 y) [* f: S5 V+ K3 \+ c2 A% X8 a5 Y
这个文献里面有，仔细看看就知道了

flydayzhu

回复 zerollx 的帖子# J( @0 S; E9 o- I+ }
4 ^4 D0 i& G7 f; T" _
恩，谢谢~

scienese

老兄的题目有点歧义啊！

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

fantafiction

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?