诱导成纤维细胞为ipsc时Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc因子病毒液的量？

zerollx

     Yamanaka 在07年发的Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures 中详细介绍了其ipsc的诱导过程，其中在慢病毒转染成功后，开始诱导小鼠成纤维细胞时的步骤如下：6 \7 A2 P- N9 B0 Y
  1、从慢病毒转染后的培养基中吸取病毒液，0.45mm滤器过滤后转移至15ml离心管中备用。2 p/ K! |5 Q$ G* |" N
  2、每10ml过滤后的含培养基的病毒液中，加入终浓度为4mg/ml 的polybrene，均匀混合。
/ N, o. t) V/ w) ^   3、将上述四种Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses病毒液每一部分等量均匀混合。/ k1 P& ^6 X6 |2 q* k
  4、吸去待诱导的成纤维细胞中的培养液，并向其中加入10ml的上述病毒混合液，培养4h到过夜。2 [7 v% J+ n0 a6 P; @

% X9 B4 d/ a. B# i' {; j
1 z0 `  [: v1 R% Y; T原文如下：
3 @; D4 d" H1 [2 w   1、 Collect the medium from the Plat-E dish by using a 10-ml sterile disposable syringe, filtering it through a 0.45-mmpore size cellulose acetate filter, and transferring into a 15-ml tube.4 i+ W( d2 H4 R7 r9 C! K$ [
  2、 Add 5 u lof 8 mg/ml polybrene solution into the 10ml filtrated virus-containing medium, and mix gently by pipetting up and down. The final concentration of polybrene will be 4 mg ml  _. B( W0 n; g. Y+ N' l
–1.
4 w6 Z) J2 I- R% v5 i   3、Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.+ c$ ^4 M# o7 i2 Z  I/ C& r
   4、Aspirate the medium from a fibroblast dish, and add 10 ml of the polybrene/virus-containing medium. Incubate the cells from 4 h to overnight at 37 1C, 5% CO2.
+ T" v5 x% W4 D# D: D; w9 J: A( ?6 H2 D6 T3 v6 J: u* r
     我的疑问是第3步说每一种病毒液取等量混合后加到成纤维细胞中开始诱导，文章中也特别强调病毒液要用新鲜的，不可冻存，可见其并没有测其病毒滴度，只是这样等量的病毒液混合，是怎么确定每一种因子实际病毒的量的，仅是病毒液等量混合再加到细胞中，那么重复做的时候若病毒滴度有所改变，那仍然加10ml的混合液，那实际病毒量岂不是也不同了，怎么保证实验的稳定性？不知道大家在这一步的时候一般都是怎么做的？
+ x) P% k& F9 O, R, V& m7 B; Z5 F" j* v+ g
补充内容 (2011-2-14 21:25):
* X, M1 Q7 |8 q改正：上述表述有误，后文中提到他测过病毒的滴度,第3步说每一种病毒液取等量混合，等量是指等病毒滴度量么？文中特别强调的病毒液不能冻存，那在测病毒滴度的这几天病毒液是如何保存的？5 j& f4 T# [# r4 L4 W0 a+ x2 S4 K8 O

; l" A9 I& F8 U( K, N3 g补充内容 (2011-2-14 21:26):6 f2 X5 Z8 i6 X4 Q
此外大家在这一步时病毒量是如何确定的？

jefferson

严格的说,测病毒滴度后,按照病毒:细胞数=4~5的比例加. 参见如下文献An Improved Method for Generating and Identifying Human
' G6 L9 y* e' M% `/ t: GInduced Pluripotent Stem Cells. 病毒上清要保存须置于-80度低温.: r; I0 f! a- |1 r1 U- X8 R1 G
: M% e+ h/ f9 D, x
但是貌似要严格的做到这个比例并不容易,而且确实病毒低温保存后活性会降低, 所以我们每次做时都同时做几线, 将新鲜病毒上清按照不同的量等比例混合, 然后加到相同量的细胞中感染." N5 D& i% D' G1 Z( T, n0 E
: U( ?: V7 j% i: ]/ B1 x7 C0 \
不过问题是,目前我还没诱导出阳性克隆,不知道是不是这个原因.

64627675

我们一直在用病毒感染不同的细胞，其实原理都是一样的，IPS我们一直在做，首先对于病毒的质量（也就是滴度）应该是要检测的，其实检测很简单，取1UL  0.5UL  0.1UL  0.01UL  去感染24孔板里面的293T细胞，48H观察荧光就行了，不需要太严格，太严格的话就要用定量了，这样就可以知道4个病毒大致的滴度差异，在用病毒感染成纤维细胞的时候，需要用一个病毒先去测试这个成纤维细胞的感染复数，也就是说要知道用多少的病毒来感染比较合适，比如SOX2病毒你可以设置不同的MOI 值 5   10  15  20，假设15的时候感染效率就达到90%左右，那么另外3个病毒也是基本上就是这个水平，至于最后要加多少，则根据你开始测定的滴度去换算，而实际上有个经验分享一下，仅供参考，比如刚才测出来的MOI值是15，你最后在实际使用的时候加大到20或25都可以，这样最后聚团成克隆的速度会快很多，如果感染的病毒少的话，成克隆的时间比较长，至于病毒冻存的问题，关键在于病毒的质量，我们一般产出来的病毒都是放在-80度的，影响有，但是冻存一次的话，还是没有什么关系的

gact

感动 你们的分享。% @, X" S2 ?. m5 d

FAYEBO

Nakagawa有次来我们学校，当时我好像问过他这个问题：从20多个基因中采用排除法最终筛选出这四个基因，但怎么保证这么多种病毒都能感染了同一个细胞呢？否则情况就很复杂，不一定能筛选出这四个基因。但他当时认为病毒感染不是什么问题。9 b2 U# B8 O' `( T6 n- o# m5 ]
确实，对于实验技术非常成熟的实验室来说，它可以将每次的病毒滴度维持在一个稳定的水平，未必每次都要测滴度。  X* |# B8 U4 n& d
我发现，这种稳定性非常依赖293T细胞珠，有些293T随便什么质粒转染效率都低，但有些就是随便什么质粒效率都很高；其次才是基因片段的大小（当然其它过程都是按标准protocol操作），2000bp多肯定比1000bp效率要低。OSKM四个基因大小差别不是特别大，只要293T很好，能包出高滴度的病毒，就能得到iPS

wangyimei

收获很大,谢谢分享!

你好好

谢谢！
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学到不少知识
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burns654

回复 64627675 的帖子* w$ b  S6 T! W. r% L% }3 _% |6 Z

4 f- z" j3 z  I5 E& b你好,请教一下,病毒该怎么冻存和解冻呢?谢谢

yangpan521

做过这样的实验，只需测第一次的病毒低度，然后后面的几次病毒诱导都需参考第一次，只有有经验的人才能做好，所以IPs诱导最重要的在于每次包装的病毒效率。这就说明IPS诱导的前期工作非常重要，每次病毒包装效率几乎一致，这完全是靠经验，只要出现克隆，后面的工作就简单了，本人经验，只供参考。

超级小葵

回复 jefferson 的帖子0 ?/ `8 w7 X, D( L- n2 w
4 W+ V% y- [2 O8 w
如果病毒在低温保存后活性降低，那诱导的时候加大比例不可以吗？
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