绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索

皮搋子

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小弟开始做绵羊的脐带间充质干细胞了！
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话说这绵羊的脐带和人的还真是不一样啊，人的脐带是一个手指头粗的管子，而绵羊是那种透明的黏黏的软胶包裹着4个管子。刚开始的时候没经验，第一根我就按照人脐带的处理办法把上面的粘液弄的干干净净，然后消化了之后我悲催的发现，啥都木有。。。
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第二回老实了，把那个黏黏的东西留着，据同事估计，这玩意就是华通胶（Wharton’s jelly），一次做了2根脐带。/ j$ C2 l) L8 }; ?( T9 \! t
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有一根脐带特别争气，别的细胞还在稀稀拉拉的长的时候，它5天就长满了一瓶子，175cm的大瓶子啊！！！！真给力！！！形态还特别好！！！
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它还长成了2层，没说的，直接1传10；
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: q" H9 `# T- b( v9 _0 i) u消化的时候问题来了，上面那层胰酶3分钟就消化下来了，可是下面那层却是纹丝不动。两层细胞长的一模一样，我犯难了。
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不管了，先把上面的细胞给分瓶了再说。
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回头再看瓶底的细胞，胰酶浓度0.25%直接上原液。10分钟后，终于下来了，现在我彻底傻眼了，到底上面的是绵羊的Msc还是下面的是？？？？- B  p$ [0 s2 z. ^/ [8 b# r
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我把下面这层也放起来培养着。。。5 t! s2 Y: E4 Y. z: l" T

% R- U7 J! p5 F# c0 g. T; l目前寻找鉴定方法，因为我们没有流式细胞仪。不要劝我查文献，做绵羊脐带干细胞的小弟是第一人。2 X1 k& o: x5 }! b. n, b/ D

" \) z1 M# m$ Q. G+ R( K就算是做表型鉴定，请问绵羊的脐带间充质干细胞哪些表达，哪些不表达？
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1 `2 U$ S% ?& ^/ |  M) A7 M好吧，上图吧。图片有点多，请耐心等待。+ l& f0 ]0 ]7 o$ q

# {; l6 \1 V) r) W背景亮的是传代后的。, W4 A7 F, F: m
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tangyvhuang

围观吧，不知道啊，

siyue13

占个楼，围观6 }" Y+ j- X. s
皮兄，加油啊

siyue13

流式！流式！
5 p- S! G1 s3 Z. X4 C& u1 \流式！流式！

皮搋子

回复 皮搋子 的帖子
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我会将做的时候遇到的事情一点点的写出来，给有像我这样误入歧途的同学提个醒：细胞是万恶的，干细胞是万恶中的万恶！
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比如那个脐带问题，人的是大约直径8-10mm的厚壁管子，按照教科书的办法就是把血管剥离下来，然后把组织给剪碎了消化。
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看到绵阳的我傻眼了，4根粗细大约有3mm的白色管子，上面裹着1mm厚的和果冻差不多的东西，用辅料镊一噜就干干净净，下面剩的东西酷似血管，你说我该怎么办？？？撕开？别扯了，这么细的玩意。
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& z) L  P9 W& Q5 E9 G% A: E* C6 M没办法，我直接给剪成碎片消化了，后来养细胞的时候细胞分成两层，下面那层难消化的我估计就是这个原因。
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什么原因呢？别人做的时候是挑去血管，而我这由于不能肯定那个是什么玩意，所以直接消化，导致血管的内皮细胞上皮细胞什么的全部下来了，下面那层难消化的就是这个东西。这是我的推测啊。
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唉，焦虑啊，一个问题接一个问题的。
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! d! D: h4 t; C  I0 u" y( M明天我会出续集，讲讲下面我遇到的问题和我更大的焦虑。

guosapphire

建议直接做诱导分化试验，因为无论做流式还是免疫荧光，都需要有丰富且合适的抗体，绵羊估计这类抗体不多，即使有你也需要有订购等待时间，而且干细胞最为关键的地方在于其多能性，你是逃不过检验其分化能力的试验的。而且不同物种和组织的MSC其表面标记也会不一样，做流式的目的我想更多是为了描述你的细胞，但是要认定你的细胞是干细胞还需要证明其分化的多能性。- e, _0 F: [$ W8 H
做脂肪分化和成骨分化都会有比较明显的表观特征，可以帮助你直观的掌握试验进展。( t$ H; q+ V. |- l  S
一点拙见，希望对你有帮助。

get0715

我曾经也遇到过做从来没人做过的干细胞的实验，也很头疼，在此深表同情，哈哈！
( K$ X; l( q$ d2 T; Q, j如果你不确定哪些是华侬氏胶（Wharton’s jelly），哪些是血管，那你就索性把你说的外面黏黏的东西和里面的细管分开处理，看是否还会有长成两层细胞的情况。
7 A% _- F2 S, M* R! u5 \你的细胞时原代时就长成两层么？多少天长成两层的呀？如果还有这样的情况，建议原代的时候早些传代，见有局部生长状态良好的时候就可以传代，一个小瓶传一个大瓶的比例，试一下。可能能解决你细胞分层的问题。
& e; `  _5 p! F* `羊的抗体应该很少，不过可能还是会找到的，那时我找抗体的时候偶尔会找到抗羊的抗体，先按人脐带间充质干细胞的表型先找两三个代表性标记试试吧。实在找不到，楼上的老师给的建议还是挺实用的，诱导分化的方法应该大同小异，还是很可行的，起码证明了是不是干细胞。
# s7 h! d, o8 x有不对的地方希望大家指出！共同进步！

haoxinaok

路过，学习！

fengxuechunyang

路过，学习了！赞成诱导分化，周期有点长，但是最能证明是否是干细胞。流式可以择机进行，但是还要选择合适的抗体。

皮搋子

谢谢各位，我准备开始做诱导分化了。