绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索

皮搋子

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小弟开始做绵羊的脐带间充质干细胞了！" w+ Z6 j' g; h, p# p

. O: o7 ]; i! y) f话说这绵羊的脐带和人的还真是不一样啊，人的脐带是一个手指头粗的管子，而绵羊是那种透明的黏黏的软胶包裹着4个管子。刚开始的时候没经验，第一根我就按照人脐带的处理办法把上面的粘液弄的干干净净，然后消化了之后我悲催的发现，啥都木有。。。- G3 J( j. z! v, m: {+ p+ h, \
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第二回老实了，把那个黏黏的东西留着，据同事估计，这玩意就是华通胶（Wharton’s jelly），一次做了2根脐带。
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有一根脐带特别争气，别的细胞还在稀稀拉拉的长的时候，它5天就长满了一瓶子，175cm的大瓶子啊！！！！真给力！！！形态还特别好！！！
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它还长成了2层，没说的，直接1传10；
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# s2 m$ }0 n% h$ \) B: A6 B4 |消化的时候问题来了，上面那层胰酶3分钟就消化下来了，可是下面那层却是纹丝不动。两层细胞长的一模一样，我犯难了。/ ]! H. _$ A: a5 h
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不管了，先把上面的细胞给分瓶了再说。4 P4 f& p$ j% S& o) v) y2 p7 D- {

4 G) [8 p' P- M回头再看瓶底的细胞，胰酶浓度0.25%直接上原液。10分钟后，终于下来了，现在我彻底傻眼了，到底上面的是绵羊的Msc还是下面的是？？？？
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# B9 L! D6 U9 N1 X我把下面这层也放起来培养着。。。1 T- ^) A- L2 |$ h3 V9 N% Z. d
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目前寻找鉴定方法，因为我们没有流式细胞仪。不要劝我查文献，做绵羊脐带干细胞的小弟是第一人。
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2 D+ W4 V/ F* ^3 {就算是做表型鉴定，请问绵羊的脐带间充质干细胞哪些表达，哪些不表达？
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, r" o$ F, r" ]6 E- [6 v好吧，上图吧。图片有点多，请耐心等待。
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背景亮的是传代后的。' [8 t3 N- X# p! Y+ V  j

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tangyvhuang

围观吧，不知道啊，

siyue13

占个楼，围观
+ @# o2 A: {9 j& t皮兄，加油啊

siyue13

流式！流式！6 l* ]/ c1 g1 i+ H% Y3 W: s  W1 F- I1 I
流式！流式！

皮搋子

回复 皮搋子 的帖子
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! m" \! \% g) l) f我会将做的时候遇到的事情一点点的写出来，给有像我这样误入歧途的同学提个醒：细胞是万恶的，干细胞是万恶中的万恶！
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; A1 H, a0 d( ?" t. R! L比如那个脐带问题，人的是大约直径8-10mm的厚壁管子，按照教科书的办法就是把血管剥离下来，然后把组织给剪碎了消化。' U0 o9 x& Q# x! G

8 v' D7 I6 T1 b- g2 G1 _5 C看到绵阳的我傻眼了，4根粗细大约有3mm的白色管子，上面裹着1mm厚的和果冻差不多的东西，用辅料镊一噜就干干净净，下面剩的东西酷似血管，你说我该怎么办？？？撕开？别扯了，这么细的玩意。6 Y" r* s9 l% x1 U9 N

8 w% v1 B& S4 Q& O0 s没办法，我直接给剪成碎片消化了，后来养细胞的时候细胞分成两层，下面那层难消化的我估计就是这个原因。
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1 l: }$ R9 g+ b) m什么原因呢？别人做的时候是挑去血管，而我这由于不能肯定那个是什么玩意，所以直接消化，导致血管的内皮细胞上皮细胞什么的全部下来了，下面那层难消化的就是这个东西。这是我的推测啊。7 c) D. O+ m* |& `
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唉，焦虑啊，一个问题接一个问题的。3 o/ y1 @9 {* k
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明天我会出续集，讲讲下面我遇到的问题和我更大的焦虑。

guosapphire

建议直接做诱导分化试验，因为无论做流式还是免疫荧光，都需要有丰富且合适的抗体，绵羊估计这类抗体不多，即使有你也需要有订购等待时间，而且干细胞最为关键的地方在于其多能性，你是逃不过检验其分化能力的试验的。而且不同物种和组织的MSC其表面标记也会不一样，做流式的目的我想更多是为了描述你的细胞，但是要认定你的细胞是干细胞还需要证明其分化的多能性。
) u' L1 _+ m! H+ X, k做脂肪分化和成骨分化都会有比较明显的表观特征，可以帮助你直观的掌握试验进展。8 w& A$ R1 F- X* D3 p
一点拙见，希望对你有帮助。

get0715

我曾经也遇到过做从来没人做过的干细胞的实验，也很头疼，在此深表同情，哈哈！# |7 s0 Z% w8 A  P- S
如果你不确定哪些是华侬氏胶（Wharton’s jelly），哪些是血管，那你就索性把你说的外面黏黏的东西和里面的细管分开处理，看是否还会有长成两层细胞的情况。* q  [; _& A1 x; k* B
你的细胞时原代时就长成两层么？多少天长成两层的呀？如果还有这样的情况，建议原代的时候早些传代，见有局部生长状态良好的时候就可以传代，一个小瓶传一个大瓶的比例，试一下。可能能解决你细胞分层的问题。
) p' r8 V! ~( x羊的抗体应该很少，不过可能还是会找到的，那时我找抗体的时候偶尔会找到抗羊的抗体，先按人脐带间充质干细胞的表型先找两三个代表性标记试试吧。实在找不到，楼上的老师给的建议还是挺实用的，诱导分化的方法应该大同小异，还是很可行的，起码证明了是不是干细胞。( n$ a" X. B& `
有不对的地方希望大家指出！共同进步！

haoxinaok

路过，学习！

fengxuechunyang

路过，学习了！赞成诱导分化，周期有点长，但是最能证明是否是干细胞。流式可以择机进行，但是还要选择合适的抗体。

皮搋子

谢谢各位，我准备开始做诱导分化了。