绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索

皮搋子

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小弟开始做绵羊的脐带间充质干细胞了！# `9 [: @! A, D

1 p- I/ a! e$ B- a; v; e7 t! @话说这绵羊的脐带和人的还真是不一样啊，人的脐带是一个手指头粗的管子，而绵羊是那种透明的黏黏的软胶包裹着4个管子。刚开始的时候没经验，第一根我就按照人脐带的处理办法把上面的粘液弄的干干净净，然后消化了之后我悲催的发现，啥都木有。。。
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第二回老实了，把那个黏黏的东西留着，据同事估计，这玩意就是华通胶（Wharton’s jelly），一次做了2根脐带。
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0 F' ^  ~# l7 B$ f$ t, E+ k1 [有一根脐带特别争气，别的细胞还在稀稀拉拉的长的时候，它5天就长满了一瓶子，175cm的大瓶子啊！！！！真给力！！！形态还特别好！！！
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* s$ i& m2 |& C& l它还长成了2层，没说的，直接1传10；& \) S) M* @; t1 K

" x( a" W! G+ {& G  i& J4 E% M: ^消化的时候问题来了，上面那层胰酶3分钟就消化下来了，可是下面那层却是纹丝不动。两层细胞长的一模一样，我犯难了。' H- b# a5 ?; Q- v0 G

% B9 K* Z9 y6 \8 E0 e' Z不管了，先把上面的细胞给分瓶了再说。
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回头再看瓶底的细胞，胰酶浓度0.25%直接上原液。10分钟后，终于下来了，现在我彻底傻眼了，到底上面的是绵羊的Msc还是下面的是？？？？; V  K) V" u5 h; H
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我把下面这层也放起来培养着。。。
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: J' w& ?4 o& B! k/ ~: V+ y7 \目前寻找鉴定方法，因为我们没有流式细胞仪。不要劝我查文献，做绵羊脐带干细胞的小弟是第一人。
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% C1 r" ?+ a, t# j' q' N就算是做表型鉴定，请问绵羊的脐带间充质干细胞哪些表达，哪些不表达？
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好吧，上图吧。图片有点多，请耐心等待。
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. {( F. O) k  {背景亮的是传代后的。
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tangyvhuang

围观吧，不知道啊，

siyue13

占个楼，围观
& g( ]3 z; u6 Q8 z+ @皮兄，加油啊

siyue13

流式！流式！
' i2 M: Z4 h7 K' B* E% ^流式！流式！

皮搋子

回复 皮搋子 的帖子
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" j' {5 h% b: e. M1 z我会将做的时候遇到的事情一点点的写出来，给有像我这样误入歧途的同学提个醒：细胞是万恶的，干细胞是万恶中的万恶！, E* I5 e3 t+ a7 n* ?9 z

! l! C+ z" R9 w$ S$ t比如那个脐带问题，人的是大约直径8-10mm的厚壁管子，按照教科书的办法就是把血管剥离下来，然后把组织给剪碎了消化。' [% F0 q- J5 g9 g

( E% L" D; v- H" @看到绵阳的我傻眼了，4根粗细大约有3mm的白色管子，上面裹着1mm厚的和果冻差不多的东西，用辅料镊一噜就干干净净，下面剩的东西酷似血管，你说我该怎么办？？？撕开？别扯了，这么细的玩意。
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没办法，我直接给剪成碎片消化了，后来养细胞的时候细胞分成两层，下面那层难消化的我估计就是这个原因。2 F' q1 h- H, Z0 R* U. y1 M& B* w! d) I

$ b5 w& `  Q, s7 }7 O3 E9 @/ E  W什么原因呢？别人做的时候是挑去血管，而我这由于不能肯定那个是什么玩意，所以直接消化，导致血管的内皮细胞上皮细胞什么的全部下来了，下面那层难消化的就是这个东西。这是我的推测啊。
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; a: u: ^3 x2 n& B& v$ L唉，焦虑啊，一个问题接一个问题的。
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明天我会出续集，讲讲下面我遇到的问题和我更大的焦虑。

guosapphire

建议直接做诱导分化试验，因为无论做流式还是免疫荧光，都需要有丰富且合适的抗体，绵羊估计这类抗体不多，即使有你也需要有订购等待时间，而且干细胞最为关键的地方在于其多能性，你是逃不过检验其分化能力的试验的。而且不同物种和组织的MSC其表面标记也会不一样，做流式的目的我想更多是为了描述你的细胞，但是要认定你的细胞是干细胞还需要证明其分化的多能性。$ O. [& E0 G; D. D9 ]
做脂肪分化和成骨分化都会有比较明显的表观特征，可以帮助你直观的掌握试验进展。$ P- L; S/ M8 I& ^
一点拙见，希望对你有帮助。

get0715

我曾经也遇到过做从来没人做过的干细胞的实验，也很头疼，在此深表同情，哈哈！& J1 H" J7 a0 b6 h( x
如果你不确定哪些是华侬氏胶（Wharton’s jelly），哪些是血管，那你就索性把你说的外面黏黏的东西和里面的细管分开处理，看是否还会有长成两层细胞的情况。  s% k. i! b! g1 _/ M
你的细胞时原代时就长成两层么？多少天长成两层的呀？如果还有这样的情况，建议原代的时候早些传代，见有局部生长状态良好的时候就可以传代，一个小瓶传一个大瓶的比例，试一下。可能能解决你细胞分层的问题。4 P  n7 i* G- Q5 o- g
羊的抗体应该很少，不过可能还是会找到的，那时我找抗体的时候偶尔会找到抗羊的抗体，先按人脐带间充质干细胞的表型先找两三个代表性标记试试吧。实在找不到，楼上的老师给的建议还是挺实用的，诱导分化的方法应该大同小异，还是很可行的，起码证明了是不是干细胞。
9 S' e' M' o- k* v有不对的地方希望大家指出！共同进步！

haoxinaok

路过，学习！

fengxuechunyang

路过，学习了！赞成诱导分化，周期有点长，但是最能证明是否是干细胞。流式可以择机进行，但是还要选择合适的抗体。

皮搋子

谢谢各位，我准备开始做诱导分化了。