绵羊脐带间充质干细胞，让我郁闷的无文献摸索

皮搋子

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( c! c5 E+ ?/ h* n/ R2 x小弟开始做绵羊的脐带间充质干细胞了！
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6 Q- _6 }( v+ e5 [话说这绵羊的脐带和人的还真是不一样啊，人的脐带是一个手指头粗的管子，而绵羊是那种透明的黏黏的软胶包裹着4个管子。刚开始的时候没经验，第一根我就按照人脐带的处理办法把上面的粘液弄的干干净净，然后消化了之后我悲催的发现，啥都木有。。。% a8 s7 L8 h& U  U9 K
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第二回老实了，把那个黏黏的东西留着，据同事估计，这玩意就是华通胶（Wharton’s jelly），一次做了2根脐带。1 S2 S% D& Z4 f3 _+ M

  l+ N" O# ~% R; X" ?5 i3 U有一根脐带特别争气，别的细胞还在稀稀拉拉的长的时候，它5天就长满了一瓶子，175cm的大瓶子啊！！！！真给力！！！形态还特别好！！！
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) ]( N3 C: u+ R5 \8 n+ y它还长成了2层，没说的，直接1传10；0 H. b+ `' e) P) O2 T$ p

5 S3 T8 [, M6 a消化的时候问题来了，上面那层胰酶3分钟就消化下来了，可是下面那层却是纹丝不动。两层细胞长的一模一样，我犯难了。  F. S: o3 t+ ]1 ~( m& D

" _7 [9 s* v; b; W& S不管了，先把上面的细胞给分瓶了再说。6 M: E( k) C0 v$ ]

- M6 V. N0 h0 ?: ]! J# S9 k! W回头再看瓶底的细胞，胰酶浓度0.25%直接上原液。10分钟后，终于下来了，现在我彻底傻眼了，到底上面的是绵羊的Msc还是下面的是？？？？1 E9 m9 t9 k+ E  V% F  ^4 E

6 d/ f7 m! V9 l. Q2 a6 c我把下面这层也放起来培养着。。。3 u7 e0 a2 A! y; r: a3 w
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目前寻找鉴定方法，因为我们没有流式细胞仪。不要劝我查文献，做绵羊脐带干细胞的小弟是第一人。, |. X% j" C3 j- U  w

9 s& B5 F: F: y& u; G% j# e就算是做表型鉴定，请问绵羊的脐带间充质干细胞哪些表达，哪些不表达？, Q( V/ e' U7 L7 R  m5 R- G
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好吧，上图吧。图片有点多，请耐心等待。
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背景亮的是传代后的。
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tangyvhuang

围观吧，不知道啊，

siyue13

占个楼，围观" I! R: g1 ~: O/ E
皮兄，加油啊

siyue13

流式！流式！
1 L/ B7 c! Y# I3 z4 q& e流式！流式！

皮搋子

回复 皮搋子 的帖子. E  ~, J5 m6 ?  G, I2 V
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我会将做的时候遇到的事情一点点的写出来，给有像我这样误入歧途的同学提个醒：细胞是万恶的，干细胞是万恶中的万恶！1 U% |1 M. p0 J% y: q3 f1 I- {
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比如那个脐带问题，人的是大约直径8-10mm的厚壁管子，按照教科书的办法就是把血管剥离下来，然后把组织给剪碎了消化。7 C) q& K) P$ S; X) I" h- X

; [$ P6 E# c6 O& a% {0 [看到绵阳的我傻眼了，4根粗细大约有3mm的白色管子，上面裹着1mm厚的和果冻差不多的东西，用辅料镊一噜就干干净净，下面剩的东西酷似血管，你说我该怎么办？？？撕开？别扯了，这么细的玩意。( S! c  h4 ?7 h$ G

; H# W  s$ g3 N6 o没办法，我直接给剪成碎片消化了，后来养细胞的时候细胞分成两层，下面那层难消化的我估计就是这个原因。5 l* g1 V7 ~5 P  w
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什么原因呢？别人做的时候是挑去血管，而我这由于不能肯定那个是什么玩意，所以直接消化，导致血管的内皮细胞上皮细胞什么的全部下来了，下面那层难消化的就是这个东西。这是我的推测啊。
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唉，焦虑啊，一个问题接一个问题的。
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6 e" _+ s7 \; K' F" O# v明天我会出续集，讲讲下面我遇到的问题和我更大的焦虑。

guosapphire

建议直接做诱导分化试验，因为无论做流式还是免疫荧光，都需要有丰富且合适的抗体，绵羊估计这类抗体不多，即使有你也需要有订购等待时间，而且干细胞最为关键的地方在于其多能性，你是逃不过检验其分化能力的试验的。而且不同物种和组织的MSC其表面标记也会不一样，做流式的目的我想更多是为了描述你的细胞，但是要认定你的细胞是干细胞还需要证明其分化的多能性。4 D4 W+ u1 c! Y& g
做脂肪分化和成骨分化都会有比较明显的表观特征，可以帮助你直观的掌握试验进展。
3 g9 Z! [1 t6 y0 ?# s  W2 X- B一点拙见，希望对你有帮助。

get0715

我曾经也遇到过做从来没人做过的干细胞的实验，也很头疼，在此深表同情，哈哈！
6 G. o' P, [' N2 Q' M* R如果你不确定哪些是华侬氏胶（Wharton’s jelly），哪些是血管，那你就索性把你说的外面黏黏的东西和里面的细管分开处理，看是否还会有长成两层细胞的情况。
+ c' U" `/ E: ~/ R你的细胞时原代时就长成两层么？多少天长成两层的呀？如果还有这样的情况，建议原代的时候早些传代，见有局部生长状态良好的时候就可以传代，一个小瓶传一个大瓶的比例，试一下。可能能解决你细胞分层的问题。2 W9 E9 ]: L- i$ {# m6 ]  S* R+ a  f
羊的抗体应该很少，不过可能还是会找到的，那时我找抗体的时候偶尔会找到抗羊的抗体，先按人脐带间充质干细胞的表型先找两三个代表性标记试试吧。实在找不到，楼上的老师给的建议还是挺实用的，诱导分化的方法应该大同小异，还是很可行的，起码证明了是不是干细胞。, m3 F+ C0 i, U( k. w+ _& u
有不对的地方希望大家指出！共同进步！

haoxinaok

路过，学习！

fengxuechunyang

路过，学习了！赞成诱导分化，周期有点长，但是最能证明是否是干细胞。流式可以择机进行，但是还要选择合适的抗体。

皮搋子

谢谢各位，我准备开始做诱导分化了。