请教如何去除多克隆位点？

军医

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

深海寂寞鱼

to 军医：
7 Y3 k: d9 V5 v" b- b% h* h& b
1 t  ?7 i$ s9 R4 `+ Q! s     设计没有问题。大胆做就可以了。) U5 L1 x% q" d$ z) Y
   
. N' t" b- ~( b& z% _8 P4 ?     几点建议：
. }. n. T8 F9 \% P* T" p+ m- N5 q
; f9 F; n# O  \; l# j0 Q6 a" Y7 _" N     1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能
" @( z1 ?2 h! Q# D
0 @/ w$ j6 @% d  R9 F3 d     2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点3 C, H. k1 h" g, y: L

, t2 j- \5 q$ S, y9 }     3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。  R; k/ l" e7 ~* n

  k* }/ ~+ e' y8 w+ }$ Y, K         因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。% ~7 p5 O. @3 l
       （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）
7 y4 R$ N" C0 t+ E. a) ^, ~* @5 z/ b# C9 M
! n* S, Z6 y9 L6 J
       希望实验顺利。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子
8 Q" z$ ?1 p% }
9 R! O8 u' q1 i5 t! q) U- t谢谢提供宝贵意见。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子
  @% V0 r: j. a1 F- p1 j1 h! P% k
5 p7 z5 Y9 C' J- d. U! P6 \请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

深海寂寞鱼

+ a. T7 p2 k0 D/ |5 u& y
6 j0 `. Z6 H5 w. sto 军医 战友
; }. P" w$ j/ V% b+ m1 W( _
3 Y% a' G3 i% A1 t+ Q; e# F" F' @: ]    DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。
! b9 V; J: ~9 {: r: X2 ~# Z* D# w) @+ z
    你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。2 E% N4 J# V' }1 X) N0 R

+ w. F) K. \0 T2 ^$ F    建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。# U) a( R4 Q- f8 r5 g8 M
6 U) ]; q+ l0 M) i+ z
    这样你就知道你的质粒是否正确。

xiangchou812

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。
9 z: C3 T% H7 D+ m+ F! f2 Y另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！