请教如何去除多克隆位点？

军医

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

xiangchou812

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。% x" P/ w# V- l2 K& g5 s
另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！

深海寂寞鱼

- S$ V  t& M6 M5 K* L0 o
5 A  R5 g  u* Q
to 军医 战友1 Q5 `. J- r  Z% u8 j0 n

6 [+ R$ v" v9 d! ~1 {    DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。  S  w& z" y3 }

' G0 I6 |1 u5 M3 K    你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。, J7 \; r* S! U$ Q( m) l# g* s

) O" ]/ j3 j5 ^6 Z: z! c; }9 n    建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。
  U! k1 _) r& D8 Z0 R3 d# [: U0 B" F6 \
    这样你就知道你的质粒是否正确。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 H* Y0 t4 m- Q' \. J, ]
' M  B) [: ^" P8 k+ L9 D( i; _: N
请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子
+ C) r( k' l. E0 d* Z7 k( Q  O4 Y$ b! L% V5 K0 h
谢谢提供宝贵意见。

深海寂寞鱼

to 军医：& m! X$ N5 f; O8 @# K( t8 x2 @- w8 i

  T+ a" G+ z2 f3 _2 q     设计没有问题。大胆做就可以了。* E1 p6 G. ~" @, g, Z9 K7 s: h
   
, O- G0 n0 a+ P* V# Z& b" N4 c     几点建议：8 t! W; a; i6 W. b/ C% `

! i; j2 T; K) b- z  k) o     1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能
- w3 N" X3 G- Y9 F
  e% s7 q; J. C) S     2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点$ u/ A# b4 ^# {$ ~) ]5 i$ R4 N2 I4 m9 v
# @- u, M4 \. n# c1 C
     3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。. h3 _( c1 z0 z( i, k! g/ s5 {  A' o
1 k. M  s: v& X6 X4 @& L
         因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。
' g' B* T. B2 G" q) X       （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）
% e# D0 U3 l( P* n1 S, T; _* \2 C

# H( c# w. v0 |7 n5 v' E0 B       希望实验顺利。