请教如何去除多克隆位点？

军医

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

深海寂寞鱼

to 军医：. T8 S; k. T# X+ y& R, p

( |+ \, I* x# U; V) O( g     设计没有问题。大胆做就可以了。
! c7 W9 I0 j0 G# `9 [' ?   
- j; j8 U* J4 p! g( q# @     几点建议：; h/ H0 N8 s4 A* L, M- g. M: A% W

' j% A6 |/ l, Z* z; H' _     1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能3 |7 [9 `3 U4 x5 h  w
: ?, r0 F$ j5 ]' i) L" o) u1 E  ^
     2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点
7 a6 o1 N& b- y: l" t
5 C" F; q7 x# E: \6 }% G3 M     3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。% Y. H; W2 g4 G: o, X5 I% c* w

9 h" Q* Q" e" w5 w3 r) R         因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。
1 s# y# a8 @* O6 V4 U       （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）
3 U  x, ~$ Y; f! f/ B' ?4 L& D1 G. G0 ]4 u9 ~$ I% X

9 Z2 M/ ]* X1 v# G3 R  r( t* e       希望实验顺利。

军医

回复 深海寂寞鱼 的帖子. F, w: V  ^  [+ n5 ^3 ^

& f( J1 ]: X+ L) \2 q% I谢谢提供宝贵意见。

军医

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6 t$ z% |- `9 ]) Y/ Y
, `% x0 |) H* V3 b请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

深海寂寞鱼

6 t0 K" U" d+ u0 R, X2 p) f+ U
5 d7 m- X0 B; c- l* l" N, D
to 军医 战友: y. k: d4 D: \6 z: f4 C  x/ Q8 M7 m

  [  ^: g/ X, D. l    DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。
+ ?# S0 c; A: N1 B2 @0 N' e" e9 P6 M  y' R% a" ^
    你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。% _4 A/ b/ z! e( U9 S: w

0 v3 ^# i# L* O3 \. S, r, G( }$ W    建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。! w5 `4 r  z* Q  Y

8 G# a+ V: v" R; R7 U    这样你就知道你的质粒是否正确。

xiangchou812

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。
( K; f. x" ^5 E另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！