请教如何去除多克隆位点？

军医

我想去掉载体上的原有的多克隆位点，在别的位置加上其他的多克隆位点，我用两种酶将原来的多克隆位点酶切后用klenow将粘性末端补齐，再用solution Ⅰ让该线性分子自连成环，大家看看这样做对不对？谢谢了。

深海寂寞鱼

to 军医：: @9 F& E, G& h. V* n

% Z$ m  {# q$ t' K/ h     设计没有问题。大胆做就可以了。
: G+ ]/ G' f4 p. B: {& {   - g  U/ w9 a2 Y4 d8 o# z5 M" w
     几点建议：
' ?' d+ K! V+ T& `' y1 J* r" J
1 O0 J6 g# q- S  u7 X4 t     1. 注意排除 平末端连接后产生“移框”等影响表达的可能7 X9 ^+ O8 @/ S) O
" T1 G3 @9 V/ i
     2. 平末端连接后是否会产生新的酶切位点
2 d$ E) b9 D+ [1 G- y) i( K: J! d  U. X8 {) D  K
     3. 如果经济不存在问题，平末端连接完成后最好把连接部位测序。- z( j4 B0 ?+ y1 S% L+ j

2 {; Z& l- R, h         因为有时候平末端连接后会少一个碱基或多出来一个碱基。
" i; w5 o( m+ Q$ e2 }* m3 z9 x1 Z       （概率不高，但是确实会发生。绝对经验之谈。）- ?/ a( c- s& Z& l1 D

5 [2 E5 t8 d6 J) ~. }( q
9 k7 \1 j; C% g1 x. W       希望实验顺利。

军医

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6 E1 {. ?/ Z3 Y# q4 @4 r' n9 _7 M8 }+ f3 W7 n
谢谢提供宝贵意见。

军医

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$ V6 @# o4 \5 l5 ]3 I/ f: F! N2 E2 \& l" O' Q
请问补平后的分子内自连要加连接酶吗？有人说直接将线性DNA转入感受态中便可以自动环化，这样可以吗，我用宝生物的solutionⅠ将它自身环化，转化后挑了六个单克隆，六个提出的质粒电泳显示大小都不一样，那pEGFP-C1作对照，CI比六个提出的质粒跑的都慢，让我很难解释。

深海寂寞鱼

3 B' U3 y8 p. U8 v* A( P
7 y( @3 Z. j" m  A& j7 a- q% p  kto 军医 战友/ U% Y: k8 i2 C' {+ I- u$ n" r, @
8 }7 g+ B5 R7 l6 K6 y3 f
    DNA确实有自连的可能性，但是几率不高，因此推荐你加入DNA连接酶。
$ T8 M; d! B% I0 V5 N0 X9 C1 `; G  q
    你用环化质粒跑电泳，条带的位置确实变异比较大。! M/ L( X  f& ]3 l
+ k$ O5 k) l9 T0 A, a1 o% ?
    建议你用单酶切将你的质粒线性化，然后再跑电泳。. N: e6 t7 ?$ E0 r. V0 m

; \# k+ [# O% z  X4 ?- t8 I; A, i* g+ J    这样你就知道你的质粒是否正确。

xiangchou812

除了你说的用最外侧两个内切酶切割后再用T 4连接酶进行自身连接之外，还可以用同尾酶进行切割后再连接，比如：XhoI+SalI。另外用Klenow补平时要注意，其只能补平5'突出末端。自身连接的效率是很高的。
! P1 A- v& V! }7 v+ Z另外，环化的质粒电泳不好比较大小。还是线性化再比较吧。祝实验顺利！