求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

mckf111

各位前辈 小弟现在做B16F10鼠黑素瘤细胞转染 用的质粒是pIRES2-EGFP 脂质体是英骏的lipo 20001 x4 g2 ^* ^' y2 r6 B
先开始在六孔板接种 大概长到70%左右行转染（因为此细胞消化后极易成团 吹打N次也没啥用 所以孔内细胞克隆很不均匀 有的地方密 有的很疏 ） 过了36-40h后 发现孔内大概只有5%-10%的绿荧光细胞 而杂细胞基本铺满 接着 消化到其余两个孔 过6h加G418（900mg/L）筛选 过三天只有少许细胞死亡 于是加压到1200mg/L 又过三天死了不少 但是新长得也很多 荧光显微镜下观察 每孔大概只有1-2个阳性细胞 于是 放弃。。。) M: C* b6 R! p: H, ^% }6 ]
请问各位 我应该在哪些步骤做如何改进 能够提高转染效率 而不至于筛选的阳性细胞太少？？？

myjnqr

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, L* K' Y9 I: @9 \. i
( E) i, p7 A% i8 O* c在24孔板里转染效率80%，在六孔板里没转进去 （当时接种密度是1*105），接种密度虽然有点低，但是也不应该都死了呀。

xuyq706

转染时细胞的密度与状态，质粒提取的质量与浓度，细胞的类型都会影响转染效率，上面有人说过DNA与脂质体的比例问题，之前没有注意过，参与论坛收获还是蛮大的！

huangcong1988

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9 m0 o* j+ G+ A7 i# l6 Y
9 ~" d  h3 ^5 H" v. G9 m什么意思？六孔板不是比24孔板中每个孔的细胞数多么？你说的是细胞密度吧？转染时候不同孔板里面细胞密度都是确定的，可能在你接种的时候你没有进行细胞计数，也没有注意细胞汇合度，一般在接种后，细胞长到大约80~90%汇合度的时候进行转染

myjnqr

细胞数少对转染的影响很大吗？我第一次在24孔板里做的时候转染效率80% 今天在六孔板做 貌似没转进去的样子 荧光颗粒还都在细胞膜上。

huangcong1988

提高转染效率可以从两个方面着手，一个是要转的细胞的状态，细胞一定要吹打均匀了，而且在接种的时候一定要使得细胞密度比较适宜，另一个就是质粒的质量，这个在提取质粒的时候选择好的试剂盒（或者说好的提取方法）一定要考虑清楚

bllx58

建议把G418的浓度降低来进行压力筛选，然后梯度提高，这样效果很好，至少自己试感觉不错，相当于是一个梯度筛选，逐步筛选的过程

双刀

细胞数少点对于转染效率的影响怎么样？

王乾

转染的效率根本上还是由细胞种类决定的，有些细胞系好转，效率高，有些就不怎么好了。但是我们还是可以尽可能的提高转染效率，上面的战友讲过，细胞生长状态要好，这个很重要。另外，每种细胞系都有自己的最好用的转染试剂，要多看文献知道这种细胞系用哪种转染试剂最多。然后自己可以按照DNA和转染试剂的比例做个曲线，看看reporter的表达效率，做到最好的转染效率。其实DNA的质量也很重要，不仅仅是内毒素影响细胞的生存，一般情况下DNA超螺旋最好比列越高越好。为了促进表达，转染前线性化也可以（可能是这样，没有这么做过）。
0 r8 C; O0 w7 E  p9 j% f9 r' W; x0 F5 O; [+ R  V" h% w8 o
如果有些细胞系确实难转，就应该考虑其他方法了，电穿，病毒之类的。amaxa的nucleofector可以直接把质粒打到核里，很好用。
) ^. J' T  P# M7 j

runsong

回复 xvmengdi 的帖子9 g) a) S# d* G* x: L7 @, l1 N

5 F3 ^* U$ V) Q% Q* d0 K细胞是不是死了，是不是用了假的脂质体