求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

mckf111

各位前辈 小弟现在做B16F10鼠黑素瘤细胞转染 用的质粒是pIRES2-EGFP 脂质体是英骏的lipo 2000
6 r: a( Q  F) _: e- F先开始在六孔板接种 大概长到70%左右行转染（因为此细胞消化后极易成团 吹打N次也没啥用 所以孔内细胞克隆很不均匀 有的地方密 有的很疏 ） 过了36-40h后 发现孔内大概只有5%-10%的绿荧光细胞 而杂细胞基本铺满 接着 消化到其余两个孔 过6h加G418（900mg/L）筛选 过三天只有少许细胞死亡 于是加压到1200mg/L 又过三天死了不少 但是新长得也很多 荧光显微镜下观察 每孔大概只有1-2个阳性细胞 于是 放弃。。。6 {. s; ?- d0 Y/ ]: o  ]; \
请问各位 我应该在哪些步骤做如何改进 能够提高转染效率 而不至于筛选的阳性细胞太少？？？

qingbao

- u) G( t) e4 q, }6 T

% j. k6 Y( f% S, h我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。9 `( K9 M4 {. ^" }& _' r' P
用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。
9 p5 _. }. ]4 R1 V$ u 文档 2.pdf (27.45 KB)

2011-3-8 13:43 上传

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2 D2 V- P! H* }+ c- w
本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
, h% n, T/ ?: Y. Q, v# Z! A又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。7 l9 r3 C# Y! k: V  I1 _4 G

2011-3-8 13:48 上传

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Chunjieliu

脂质体转染某些细胞的效率较低，可以试着改变一下，脂质体与质粒DNA的混合比例，有文章指出当脂质体/DNA为1.25时，转染效率最高，楼主不妨试一下。

mckf111

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  s: o& O4 k+ p, E9 p# D; I
; y3 n2 c* r( @; `$ W- j非常感谢 再问下筛选前细胞融合度大概要多少合适？

qingbao

回复 mckf111 的帖子/ p* S* `( k# t

# c0 @7 E7 Y: Y. o0 k9 Y( r9 G1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。5 o$ Z2 \4 k2 E4 y, h
顺便再说几点要注意的：  f8 Q- P) z3 D$ f7 y/ l1 V4 ^
1） 得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。
" k' v# s# u7 c. ~8 X4 X' n2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。0 M/ o6 S  n8 m1 o7 n" N
3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。
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qingbao

稳定筛选的原理：
( l: `7 L8 |! Q+ e3 }' |8 q被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。
% v/ Z' G4 U* L6 ?新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。
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crystal

最近刚做了转染，有点小小的想法，不知道是否合理：, y# ?1 S# Y5 f6 C, E  s, i; V
种板的时候，每孔细胞的浓度不一，这样等到汇合达到分别达到70%，80%，90%的时候进行转染，然后再根据转染效果看看，你的细胞在多少密度和汇合达百分之多少的时候转染率最高！再有就是分别调整DNA/LIPO的比例，你可以1/1.25和2/2这样做几个孔试试看，这样也许也能测得你所转染的最佳比例，自己想的，不知道对不对！

mckf111

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" Q, M& _( K( @6 ^  y, A9 [* _% b) m5 M9 Y0 c$ L( Y
你的转染效率如何啊？

fendou9

转染还是要看具体情况的  建议提高脂质体也质粒的比例

crystal

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8 y4 p4 {; o: S% i3 c4 Z, c! R/ Z; q2 S! x) B
大概80多的样子吧。