求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

mckf111

各位前辈 小弟现在做B16F10鼠黑素瘤细胞转染 用的质粒是pIRES2-EGFP 脂质体是英骏的lipo 20008 x  _; I2 w8 X4 j
先开始在六孔板接种 大概长到70%左右行转染（因为此细胞消化后极易成团 吹打N次也没啥用 所以孔内细胞克隆很不均匀 有的地方密 有的很疏 ） 过了36-40h后 发现孔内大概只有5%-10%的绿荧光细胞 而杂细胞基本铺满 接着 消化到其余两个孔 过6h加G418（900mg/L）筛选 过三天只有少许细胞死亡 于是加压到1200mg/L 又过三天死了不少 但是新长得也很多 荧光显微镜下观察 每孔大概只有1-2个阳性细胞 于是 放弃。。。
3 s* x# n# y. [6 j请问各位 我应该在哪些步骤做如何改进 能够提高转染效率 而不至于筛选的阳性细胞太少？？？

qingbao

' F% S' J& v. a3 x3 T. Y

$ P' S, a* T5 J. u7 X我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。2 |5 b- _" d( p$ {' v4 j0 |
用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。
4 P: A+ G! Z& O8 E5 ]/ f/ t+ ? 文档 2.pdf (27.45 KB)

2011-3-8 13:43 上传

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* r$ U! I0 [* ]- G6 k9 s
本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
5 i( F2 {8 N9 V: k( @又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。
" g8 ]0 F5 Z$ D

2011-3-8 13:48 上传

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Chunjieliu

脂质体转染某些细胞的效率较低，可以试着改变一下，脂质体与质粒DNA的混合比例，有文章指出当脂质体/DNA为1.25时，转染效率最高，楼主不妨试一下。

mckf111

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* @4 q$ z+ ]3 t2 z% G+ a2 \; f, Z2 u' K
非常感谢 再问下筛选前细胞融合度大概要多少合适？

qingbao

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  c; H% M* L6 y3 j& j/ [$ ]. g9 p" N# C) s) \& R
1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。
5 k8 D; P3 w  z' D1 u- M顺便再说几点要注意的：  ?! \, `. x2 f" u! J$ u# h
1） 得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。
: m3 p5 \0 O6 G8 t2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。
7 t4 s) C9 e. r6 H7 X8 D' w% I3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。
. D& N8 k. |6 _* |- e, M

qingbao

稳定筛选的原理：
' o+ I8 P$ \# p8 V# d被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。
; K4 H& ^- i; _; I0 m新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。, D" Y4 F2 }) B' {6 f* A3 E3 Z

crystal

最近刚做了转染，有点小小的想法，不知道是否合理：
& o2 k0 O5 {0 D- X种板的时候，每孔细胞的浓度不一，这样等到汇合达到分别达到70%，80%，90%的时候进行转染，然后再根据转染效果看看，你的细胞在多少密度和汇合达百分之多少的时候转染率最高！再有就是分别调整DNA/LIPO的比例，你可以1/1.25和2/2这样做几个孔试试看，这样也许也能测得你所转染的最佳比例，自己想的，不知道对不对！

mckf111

回复 crystal 的帖子2 W+ d. F( T) u( l  r

/ K: n4 f+ D, l; m: h4 R你的转染效率如何啊？

fendou9

转染还是要看具体情况的  建议提高脂质体也质粒的比例

crystal

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- Z3 Y. u/ i% L. n  C2 _' H) X2 t, L1 `5 I$ o1 S3 a0 L
大概80多的样子吧。