求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

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) U5 {6 s; Y* m% G3 M+ R7 Q7 y) r8 X* }5 {. m+ K
还想问下您 那knockout DMEM 是不与SR匹配使用呢？

congxiaoran

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/ n6 u! S4 W* \2 T1 f: k
, W( m/ r8 B7 k$ N2 [" e谢谢啦

nculsa747

回复 congxiaoran 的帖子* [; t: U$ s& ]6 |* Y
7 `: a) d4 h4 y
knockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

congxiaoran

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$ _6 x! P$ p/ F5 P% o% W$ a$ W2 y
不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

congxiaoran

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: U9 e) E  j6 `2 A( q' ^- O
0 T2 q* i: V' o6 z. }4 @' ~谢谢

congxiaoran

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9 g) o' F& C; W3 R6 o# o; C! M9 T: p: y$ q
多谢 受教啦

congxiaoran

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1 C, o1 }7 W; l5 W. w& O; q- Z- R: `" `# {6 [0 t# f% K
非常感谢

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：
' U" W. ^  o; s. X" q: W1.提前将保温杯放入-20℃待用.
. ]$ y% a- B/ e  h* p" L2.提前两小时给干细胞换液.
! _( z7 g& m7 l. h) C7 Z3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
! {6 u3 @" \" z( y8 ]4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。  }1 t3 f3 F# f( `2 g! c8 B6 a3 T  K4 A
5.加入1ml培养基吹打均匀0 z: E  Y+ n1 n4 Z  K/ b
6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。
! l2 A' q& k1 T9 \  k' K7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
& @  N0 }. r4 _) E; L) w) ]4 S: `8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。
3 b! z- g  K8 ?3 U9，送至-80℃过夜。1 E5 T& Q  A" g# ^; K) C, Z
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。
4 p7 @* w( _4 E2 J' g我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。0 T- ?7 i& n1 T+ f7 N* I5 V
细胞冻存（缓存）2 t/ z% D* I$ E8 D
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。; N; E4 @4 ~5 m$ O  T' _
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
* D. L* w0 i/ z, X1 D2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7/ ~" U% T6 D+ o
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
8 {7 z+ Y  ^1 ^: ^+ d$ d4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）1 J- ?- r) ]$ B' r1 ]; A; a

& Z0 Y  X. e" b, p4 L" @  T. b细胞复苏（速溶）! n4 n; x9 Y8 A% e( c
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。5 I% m2 Y: q! u! G' x
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
* e6 J/ Z( V: H, A/ Y' U（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％% l0 U+ m' K/ M