求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

请教下如何冷冻干细胞 怎么操作和需要哪些液体 谢谢

nculsa747

自己先找一下嘛，非常简单。90%KSR+10%DMSO。细胞冻存液有现在的，如cellbanker、millipore都有，去找一下吧。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。5 o' p* u. T3 }
细胞冻存（缓存）$ D! g! I' @# b! Q* N; R; z
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。
3 d5 ~+ f% ^/ P$ j1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）
$ r; n4 k4 L( o; i" E" v( [- h7 a2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7: [9 o7 T9 V( q+ ?" X3 V
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
' [3 B/ @! L2 \, }- L& K8 M3 r7 t4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）* U+ [+ O/ _( r: o

* t* b! d9 k) o* w. C# G. J细胞复苏（速溶）- T( d4 e% I* J- D
冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。
% x$ F3 @+ z3 z$ d5 @5 j0 E计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。/ [& w& b5 u( `. K: x: S' \
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％
! K' P& B: M. y5 S( p" ~/ x# m) L# `

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：
8 ?0 X) [- ?/ z, h: T) m& Z1.提前将保温杯放入-20℃待用.) M* p4 [; T4 S  e" k0 o  K4 J! A) j
2.提前两小时给干细胞换液.* h6 Z" U+ s+ b6 q) K8 q  A: y1 M. G4 ]
3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
) t; y2 A+ z8 [& u' |5 z+ J  L4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。
' F: J# b& f) R7 i5.加入1ml培养基吹打均匀1 p4 x, t; k1 f3 c0 |( c( m
6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。
. q' U7 B& h$ Q% j0 j- p& h8 x7，分装冻存管，每管大概总液1ml.1 [2 |+ e4 U1 \5 n- w3 m; X
8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。
, B. d- `7 R* P# z2 D9，送至-80℃过夜。" z1 A: |6 ^! l7 G4 {
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。8 `- @( F4 \2 [, e& e3 s
我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

congxiaoran

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0 Y: x, ^1 V' {' Y7 m' I3 F5 c8 h" E! L4 J4 d
非常感谢

congxiaoran

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" F2 _) A2 w( p4 r  S+ ?; m, z6 f: r1 X; b! @
多谢 受教啦

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子, x' ~" j! Y+ T) Z
4 A$ y8 A0 j; t; F3 v5 `5 t5 S7 M
谢谢

congxiaoran

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  x1 y4 n4 D+ H+ s/ m  D1 j" f* x/ ]1 L  z
不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

nculsa747

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# C0 P" D2 i  [
9 g- {0 A2 W" x2 Qknockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。