八一八，为什么养个MSC总是有这样那样的问题

飞翔的十字架

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/ o/ q/ U7 f/ c! ~" F1 j: o3 D1 d接触MSC已经两年了，从看着师姐做到自己独立操作，和许多论坛的朋友一样，碰到了不少的问题，也经常上来请教。不断的碰到问题，不断的学习，不断的解决，现在就以大鼠的骨髓间充质为例，和大家八一八培养中的一些问题和我的经验，希望和大家共勉，养出好细胞。
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细胞取材：
* q$ p6 t8 K5 v% S; c7 D6 b既然我们提的是原代细胞，而且是需要纯化的，那么细胞的供体就至关重要。理论上MSC约占骨髓细胞的十万分之一，与供体的年龄有关。但我提细胞的过程中，经常遇见老鼠骨质的异常，包括骨质增生，骨质疏松以及软骨化，虽然我没有跟踪统计从这些老鼠骨髓中提取的MSC的情况，但不可否认的是这些老鼠的身体状况或者说是它们的骨质除了问题，进一步提出这样一个问题：难道能从这样病态的老鼠骨髓中提取的MSC不会和正常的有差异吗？
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我在重庆和北京都做过MSC，从不同的单位购买过大鼠，结果提取的细胞大相径庭。我从某个单位前后买了近20只大鼠，无一成功，不是没有细胞就是长的奇形怪状（不点名了，怕人家找我拼命）。而即使从一家单位买到的大鼠，这次做成功了也绝不代表下次也能成功，在培养条件完全相同的情况下我只能分析说是老鼠的差异导致的。我现在的做法就是一次买8-10只大鼠，一下午搞定，只要能从2-3只中提取处状态良好的MSC就心满意足了。" p1 N* I% P! s! \

5 X( B6 O* `7 ?& t/ z( y我曾经和同学说的：能不能提出好细胞，在你做出要杀哪只老鼠的选择时就注定了！
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培养体系：
2 Q% p4 V  k$ C' N; {$ O9 n% O有了好的细胞来源，你还需要给细胞一个很好的营养环境。一般来说就是培养基＋血清，或再加点双抗，glutamine和其他生长因子等。8 I: J1 G! a6 ^3 Z& C7 R
先谈谈培养基吧，一般大家为了方便都是买的液态500ml装的，不过某研究所老师告诉我，他们一直是用粉末自己配的，因为粉末一般在运输途中也是－20保存，比起液态的4度保存其成分会更加稳定。有一定道理吧，但总是觉得麻烦，而且我也曾买到假货。不过我认为液态的问题也不大，注意开瓶后别用太久就行。" `7 l4 Q5 q. l& F" G6 k
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血清，大家公认的MSC培养中的重中之重吧，问题也最多。从做MSC开始，筛过很多血清，相信很多人也做过。国产血清确实质量不怎么的，偶尔有几个批次好一些，但总不能长久或不稳定（有个国产血清还是不错的，用过一段时间还可以，不点名，有广告嫌疑）。但进口血清呢，国内市场上的假货太多了，越是大品牌的血清假货越多，因为利润高啊。即使你是从那些大公司的官方代理购买，也很容易买到假货，甚至有时比买到真货的概率还要大，假货怎么进入到流通渠道的？从公司高层往下一直都有可能，甚至是送货人员，他把你的货给换了，结果你和公司怎么也扯不清。其次，我一直怀疑西方对中国的血清使用是否有限制。我们都知道，某著名品牌的血清都是澳洲或新西兰来源的，可为什么不卖美洲的货呢。我从特殊渠道搞到这个品牌US的货，不贵，500ml人民币1800，结果很好用，比走官方代理的澳洲货好多了（你们别和我打听哪进的，特殊渠道，呵呵，不能砸了人家的生意）。告诉大家一个小秘密：Gibco血清瓶子底部边缘处是有一串很小的数字的，大家回去看看哦。总之，我的经验，进口血清肯定比国产的好一些，但你一定要找到一个长期固定且能给你搞到真货的供货商，不然你还是用国产的吧，总比假货好。国产的好血清1.5元/ml算不错了，太便宜的就算了吧。
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0 U, h* w7 N; [! f其他因子：双抗我是不加的，操作比较细吧，不污染（小得意下），有人说双抗对MSC不是很好，没有证据，大家自己琢磨；glutamine，我一般也不加，主要是我的培养基用的超级快，跟喝的差不多，要加的话我建议，比如你的培养基要用7天，等用了3，4天了再加点，这东西太容易降解，有条件就用Glut Max替代。生长因子，我现在一般加1ng/ml的bFGF，和别人学的，没有充分实验证明它的效果，求个心安。8 ~% T1 k' k/ E/ U: m% K0 b; C
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Protocal：6 |/ ^9 A- |! w& n( B9 Q( \7 V
刚开始做MSC，要不师兄师姐带着做，要不自己看现成的protocal摸索。Nature 上那个MSC 提取的protocal也就这么几行，读几遍也就会背了，可100个读者心里有100个哈姆雷特，那些蕴含其中的细节未必人人都理解的到。老鼠断颈处死暂且不说，取出胫骨和股骨，怎么取，每个人都不一样吧；把骨髓冲出来，怎么充，有人把骨髓冲出来后再吸再充，有人每一下冲洗用的都是新鲜的培养基，对细胞会有不同的影响吗？第一次换液什么时候，8h？24？72？全量还是半量？没有谁对谁错，个人理解不同，操作习惯不同，能养好细胞就行。养细胞就像养孩子，肯定有许多问题（那些一直养的很顺的就别拍我了），别人的protocal可以学习，可以照做，但重要的是我们要总结出自己的protocal。遇见问题也很正常，我们可以多方求教，集思广益，但在你问别人之前，一定要有自己的想法与主见。
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5 d% i2 t/ y: N3 R细节决定一切：
' @5 f% I0 Y5 @" C0 W- w  B也许养细胞是一个运气活，但它一定是个技术活，特别是所谓的干细胞，他们太娇嫩了！在这里，细节就显得十分重要了。举几个例子：给细胞换液前要热培养基，你要热多久？短了温度上不来，长了glutamine快速分解，它的分解产物对细胞是很不好的，如果你将培养基遗忘在水浴锅过夜，恭喜你，配新的吧；你的血清反复冻融过吗？拿了40ml分装的血清没用完怎么办，如果短期内你还要用，把它留在4度吧，急着配培养基血清又忘了提前化怎么办，直接放冷水里化吗，拜托，好好计划你的实验好不好；被让你的细胞在胰酶里呆太久，不好消化的时候磕磕瓶子，对细胞的刺激肯定比胰酶少；我见过最恐怖是移液管把细胞悬液吸起来还过了两遍火，说是灭菌，我可怜的细胞你死的惨啊，凡此种种...' S, ^, ]" X' w. g5 |+ t6 B

7 F# y: A+ a7 ~有时候细胞长的不好其实是很正常的，长的不好，分析下原因，积攒下经验，也不要钻牛角尖一定要知道为什么，它是细胞而不是机械，而且是我们了解的并不透彻的细胞，人还有头痛脑热身子不爽的时候，何况是细胞，还是娇嫩的干细胞。况且就我开头说的，可能你提的细胞里就是没有MSC或很少。怎么说呢，多实践，多积攒经验，那么养出好细胞的把握也就越来越大了。
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叨叨了很多，其实也就一点心得与坛友共享，望大家都能养出好的MSC。

郝晓英

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呵呵  不可置否   你说得很激动啊  / v( \4 n! c1 B: T! N. @
但是我觉得如果你能把很多细节tips写出来跟大家分享  那就更好了啊0 c/ d* L7 V. u2 {1 W# U- K
比如消化时间   胰酶用量等等

飞翔的十字架

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大少爷

楼主确实有够细心了，不过我们目前都用无血清的培养基了，且在培养时也不加双抗，它对细胞有伤害。

illidancui

顶一下

leungyk

謝謝分享！我就是要獨立操作的一個！
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想請教："急着配培养基血清又忘了提前化怎么办，直接放冷水里化吗 "1 G% g: g6 k2 w8 \, l! d
你的意思是~ 要從-20C放到4C一晚，讓它慢慢溶化嗎？$ }1 ~( j4 b5 f/ E9 Q: l
我也想好好計劃我的實驗~可惜我是做臍帶的，孩子出生並不由我好好計劃..

飞翔的十字架

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0 X: a( A# ]% r3 u7 S! s5 X" tinvitrogen 的血清使用指南：; @- m' f1 h/ X. A1 n' s

3 p8 ?7 S4 S3 W6 Z血清从冷冻箱拿出后，先置于2-8度冰箱使之溶解，然后再室温下全融
# |9 c: q" N1 B% ]% I/ N" r7 P融化的血清若存放于4度  勿超过一个月

郝晓英

飞翔的十字架 发表于 2011-6-7 16:24
8 j  L2 x$ j, x2 v3 h5 @给晓英姐加个分 欢迎参加讨论

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谢谢哦  哈哈

生物化学zy

培养液每次用时从4度恢复到室温可以吗?还是必须是37度预热?

ytumuyangren

对于说到培养液的问题，我们实验室用的都是粉末状的，自己配，效果很好，而且储存的时间相对比较长一些，当然在没用完的培养液不定期要加入谷氨酰胺，而且粉末状的在运输过程中比较方便。还有血清的问题，很同意你的观点，国产的的确不咋地，我们就在这上面吃过亏，可怜了我们的细胞，不过现在我们都用进口的，而且在特殊的MSC细胞培养过程中，我们都用hyclone的，这个血清应该是南美产的，欧洲产的血清我们老板不让我们用（怕疯牛病，呵呵）。另外，我们养MSC取的材料都是胫骨处，我们也不用培养液去冲洗，直接将经过酒精浸泡的胫骨放入培养液中，用灭过菌的止血钳或者骨钳将其夹碎（尽可能的碎），然后直接将培养液和碎骨一起种到培养皿中（当然大块的骨头还是要去掉的），3-4天后晃晃瓶子，让没有贴壁的MSC贴壁，5-6天之后再换液，这样操作完后，污染的机会很小，在我老板给我们示范之后，只要我们培养的MSC个个都长的很好，而且从来不加双抗。我们实验室的一点经验，呵呵，预祝大家的试验成功！