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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑 , G" \" q' V3 P& e
' m! a: V7 \; R' W刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西. b' O0 `+ _2 g& a
包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等. b( ?4 `$ t/ O5 b% ?
一、目的2 m0 m! p5 V" t/ p: c& K8 Q' v, W! @
采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病+ o U' v' Z* D. G
进行滴度测定。( w3 e+ _ h. x% q+ q! {
二、材料
. c) I( r% e" D8 C1 d/ C, D, Q细胞株:293T" Y: ]/ o+ |' \; Q
菌株:大肠杆菌菌株DH5α1 I) e n! z- _+ Q
病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.0 D; ^ ]% t) w ~ l' @1 N- x$ p
DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种8 t! A9 _6 C+ Z9 }3 ~. g; w
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证4 E) O) Y% s7 G1 M; B* {9 @! e! r5 f
所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。
- }3 X5 D5 V2 m5 |3 G1.主要试剂0 y+ [# r4 [: K9 I! E- x& W5 w
台盼兰 美国Sigma公司
" I: E" [' O! y! a# u$ d* ?6 {1 _ 胎牛血清 美国Hyclone公司- }: G( z# h( A5 v
DMSO 上海生物试剂厂; h9 ^% l' H( c; \: e& `
DMEM 美国Hyclone公司
+ y( g/ p$ h7 w3 I Q+ c3 v- R 胰蛋白酶酶 美国Gibco公司
' \1 Q J2 D, F# k7 K: e4 J/ n2 x Lipofectamine 2000 Invitrogen
6 | |4 s7 d- [2.主要仪器
. V) g+ j' O0 \, r$ Y6 C4 T 荧光显微镜 奥林帕斯; T0 \% o7 x/ _. H0 B' o
CO2培养箱 上海力康( t- }+ s& o6 f' E- g' G" @) x
生物安全柜 北京东联+ a( N' o6 x( E' j
Plus-20离心超滤装置MILLIPORE# y7 h3 n: ~. k# t$ m
三、方法
0 u2 y9 L% @' Z1 I8 X5 j# n（一）293T细胞的培养
( `7 E& G, Y6 ~' X! O8 f1.293T细胞计数9 d. v* ?$ ?" f2 v S
用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液
% F0 g8 T! o( ~" A! Z中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
5 h! v1 S6 q% |! }细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
* V% O( k& `& {' }
8 w; S- X5 ^# {, L# l2.293T细胞冻存
2 D- y' d5 d: O) g（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml
- J7 G! r; V" ~+ q; W0 x/ S/ p（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混$ ?% u9 o6 ?, [6 ^, n( l
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。
$ U6 s8 F w! L2 r* i+ y7 v6 B5 h6 k8 F! I. r
3.293T细胞复苏/ L' \' R( z- V
（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
2 ~! m' f$ i5 g, o5 G3 x S* w（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
" q4 G: t1 ^( S6 ?/ Y( ~) f（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml
$ l& x$ \3 ^" M9 X7 p5 _, n3 r& J含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
3 ?9 O/ Q9 O, `! Y4 l, A# J" g（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
" T" s$ u2 j) x9 `- g- ^. B* g' e1 d# k
4.293T细胞传代, X, I' u) B9 V2 ]6 c! u$ F
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
% z" g3 H7 Q4 p* z后弃去PBS溶液。 M. n F% b$ u0 ]
（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
" T) l6 {& O7 x5 r3 L0 C3 Y（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，5 y8 b; H, K0 f4 E# x+ `
将瓶壁上的细胞冲洗下来。
# X, W3 J5 L3 ^- T7 j! I（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
& ^: Y0 }+ \! c2 s0 F6 j) g
( Z7 y/ e. `+ G |9 M$ j! t（二）慢病毒包装) q1 p' f4 N; V+ Q, [
1.293T细胞转染
1 K% U9 S6 g" ^（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基
! o- j) @4 v8 L4 [7 {8 ^5 `调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。 g, m' F9 S% |3 J( w1 u. E# k
, x; Y) c$ l( n1 {1 O5 B9 Q（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
0 K8 b% @( G7 t9 L! p* U（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。9 _5 O9 {$ L# f3 f
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂
! L' t. Z+ Z" G; L7 e2 E4 v) H在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。& m: M3 X7 f3 _$ \- z) m! q7 }
（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混
8 z3 k+ _0 S0 ~匀，不要振荡。必须在5min之内混合。. |# p) W3 r. v; ~! G0 l: \3 l
（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液
* e& D, h( Y! x; _8 q的转染复合物。
) O( r* F( x6 j+ s( A; s( k（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，7 K3 j4 _! k$ F' C& \, ~
于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。 S9 Y$ {: p2 Q* q$ b, g0 } u
（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，/ y' O# L' s' s0 }* P
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
7 \3 X' w ?7 W2 C7 [（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内! C" E& ^8 w1 `, Y
继续培养48h。1 m F; z! c' i5 }5 f
* }" f9 @: H3 ~; @4 ^2.病毒的收获及浓缩
" Z+ c+ C, `% F' I* e（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。
5 r' ~8 [3 t- D$ q（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。, O& |8 x' a5 l2 j5 [& U g& H
（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
2 [& G4 P$ a# R: o @# m$ r8 U* L+ W（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插
( `0 }0 i1 E$ U到滤过液收集管中。
( {6 ?8 w6 o+ ~8 N( m6 G/ M3 X9 H（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。/ d8 B% c9 Q2 G
（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。% Y$ p7 J+ s8 \- ~% s2 E8 Z( b
（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
1 H8 r- g5 I! Z$ m$ U（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。8 [% S4 I) P7 ^
（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从
' q, d9 \6 q* I- h- c! i样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。2 C+ Q/ C" I) r. [6 W6 q
（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支
$ K4 \! e' X+ o/ U3 A T/ u K进行病毒生物学滴度测定。9 w. n! F# R2 I; e
5 G- R9 V' a( j, \- u3.慢病毒滴度测定
+ F. O6 z, Z, u) I) k! t孔稀释法测定滴度 ]; h6 D% z9 |( F% M
（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×1047 y8 l# A) x; @" C' L5 w! r
个细胞，体积为100μl。8 }; W" Y. i! `! }$ Y3 E) _4 a
（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl
6 l- n T( r# F5 d& Q无血清培养基。
5 u# P, V* U. F. t F5 r（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入$ |# D0 X: f- a) R$ \
到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
) r4 d- _! r+ E" D% c（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒( {( h9 P/ V8 T Q2 q# Q2 N
溶液。放入培养箱培养。# _4 Z8 P1 s* x; w+ |0 t! H5 g! ]
（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。8 N8 f# k9 G, ^1 P! \( y
（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。- n3 @( j [6 n* c+ o! Z. ?8 K, ^6 Y! V
说明：* n, B T* ]) g8 H# o3 B2 W
第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；2 Q5 p+ V" b8 P+ V5 u' @8 d3 `3 W
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；
! B) R9 `& O. \- `5 V* R. |: y第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；
: S5 d% x6 x c7 [依次类推…% ~' x* C! G5 J5 I6 l0 N1 E2 H* o5 E
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；% }; f- K4 i' O# Q! g; A
第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；* j# ? |6 ~6 O; y5 v' B
, ~ V/ v2 N* g# e, K# [
四、结果4 I+ z" R" g p& V
& h! y; B! t2 |7 C) t0 U
慢病毒滴度计算:. P" [4 B, n+ d1 _5 K6 S
根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个1 O* u( s b& V& }
带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度
: F9 P( M5 U' P7 C4 V$ @& g, s7 Y等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,4 @5 |" T6 E: T0 e$ u( D0 C
也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结; \- j4 e+ l. v5 F% K/ e
果如下：
- u @! }# }+ v S3 ^Oct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml9 i' H# b0 [" H6 ^7 F
Sox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
/ M1 L5 U( N" e- uc-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
2 I: Y9 v+ ]7 B2 {4 u5 }) FKlf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
