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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑
% w a: g% b3 M. H2 l9 Y6 n
! p0 X4 }( c5 b刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西; a/ b6 B0 d2 {6 W% a) U' D6 \
包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等
/ t+ X: F1 d* I1 P# t+ n2 K一、目的
+ v3 v+ s; W% ~) b9 b采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病% F% E/ |9 m( ]1 p( i
进行滴度测定。
# e0 r6 o2 j) E$ `二、材料
0 |% x+ \* z' _细胞株:293T
) Z6 K2 g4 {- Q. o9 j8 |! X菌株:大肠杆菌菌株DH5α
. X- j! E3 t5 j9 \- m病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.0# d- n- s |: _9 k& Z
DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种1 m, ^$ ^! }+ B$ c+ F
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证
. k, B& |# C1 G1 Y所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。
6 f* \! m. y* n+ T) G9 y8 H' i1.主要试剂
1 o0 Z2 K3 f1 Y3 c 台盼兰 美国Sigma公司4 d* Y1 v/ i* n: e$ D: Q3 Y
胎牛血清 美国Hyclone公司3 {3 I% l1 w8 s# L* h, f
DMSO 上海生物试剂厂4 y# ~7 r9 i0 Q
DMEM 美国Hyclone公司
. i1 Z0 T- w- N' l1 F ~ 胰蛋白酶酶 美国Gibco公司5 g, B; J! F, h5 R. f
Lipofectamine 2000 Invitrogen/ R) {: j6 R% I. g
2.主要仪器9 n9 a9 {- B! l9 {
荧光显微镜 奥林帕斯5 y2 l! h$ v# B! z
CO2培养箱 上海力康 k- m3 r1 G5 I- ]7 R4 ^, Y- d
生物安全柜 北京东联
, _% g c3 G/ a( N5 a0 {* U- F7 q8 ?Plus-20离心超滤装置MILLIPORE4 Q& E/ p! s% H( N) ]
三、方法
$ o7 @ o1 W$ R2 l（一）293T细胞的培养
( {% P3 K( C. [! K5 u* p# J0 t1.293T细胞计数
9 b! @; U W7 C" Q6 N 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液8 C2 c4 I* V8 x; L# h4 c' E
中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
1 Y) a! h6 s$ p细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。. ]! l( U! Y' k, k! g
) N7 K2 ?8 R7 X4 p
2.293T细胞冻存
. o# s) d; N, {（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml
+ K3 n7 }0 i- P' E m6 o# o（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混
' V1 f$ E( h0 j5 Z; ?* R# g; |匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。7 X; x f- w; `5 k7 z$ }
2 Q5 D k9 i6 H3.293T细胞复苏
+ _8 u& h3 c& [- Z: p0 p（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。) |$ f7 y1 `% [' x' P: J$ C
（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
2 ]: @5 q1 J3 x5 k W! |（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml& c# W3 q1 v+ u+ @; {
含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
& Y7 P" m0 }; Z6 R（4)次日更换一次培养液后再继续培养。4 f e& I0 C! D8 H! }5 i9 _5 z
. c2 { F0 v) |6 j+ }4.293T细胞传代5 L' T9 c, C# R& J' [, a6 v7 ~
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
/ A1 m# {) n! v- X" v3 X- ~后弃去PBS溶液。, V2 D+ ~1 c5 ^7 X" f/ U+ W- s
（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。5 P& x7 ?2 {" r3 J u: h
（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，
& g. C9 |; ?+ B \ z' ]8 K将瓶壁上的细胞冲洗下来。! u. l1 y' R7 M: @
（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。
1 B8 G$ t7 n2 V1 Z( |! \. y% |: N- ~" K
（二）慢病毒包装, u' x, R {/ Y* t* r
1.293T细胞转染) ^! {5 k, z6 X8 h
（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基
1 J4 W- r, {4 {& F* e `. H( \8 i4 `调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。
5 d! B$ c5 T8 l% ^; q1 p& ~9 A& E% [! z: F1 v
（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
7 [7 |1 i! x/ C( @- g( a（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。4 o# P. L/ L5 k
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂
1 u5 e6 E# {$ \5 R在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。# I9 c; I) u* f- ]3 |" L# s/ |
（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混) D& X5 q* s- G) ?) v, B
匀，不要振荡。必须在5min之内混合。4 P, Z+ S6 l* L! j! ]
（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液( j2 H3 z- s8 L; {5 g
的转染复合物。& C$ a$ I( S/ R8 Q
（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，) C/ N( r/ m2 g4 V* h* A4 b
于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。, o. A/ k/ k7 m% I J
（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，( y% Y* a( Z/ X7 n; Z5 K: f
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
; o* G) Q4 \% t- {% a（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内/ @" t. |0 y$ T5 q" p# k& U% `
继续培养48h。
6 M$ y7 E7 T" x2 H& m! R: c) u: Z+ h& ]% h3 b- }' F
2.病毒的收获及浓缩+ ~+ y- L* r: s0 @
（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。1 x. F' d% E, \3 L) I6 {2 ]
（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。
7 r* L0 |) Y: b: }2 ~! C（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。& [3 P- c" _, @( M) h
（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插' {" h1 q* W: y7 |2 x# l
到滤过液收集管中。; S) Z5 u6 c$ r' h2 Q" I6 Y) v1 M
（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。
. D5 x2 `; R; N) v4 u（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。& q7 ^0 }/ b5 h* `& I' R
（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
. f) t9 f6 a* g2 h; Y（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。
1 X0 {! b8 B: q- X; b4 [& Q（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从
7 q: L) @' n/ A6 Y. P样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
3 a- z; _. K" R# q（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支) T7 q( X) M* E5 W
进行病毒生物学滴度测定。7 t' h7 D [& M6 n z9 ~$ u! g! X
- }6 _# D; r6 t9 a6 u8 L1 ~
3.慢病毒滴度测定
, }% D0 z9 x3 n/ T t孔稀释法测定滴度* W$ N6 S, I* x
（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104: |% d7 O5 f& R# I; r5 E$ n
个细胞，体积为100μl。
7 u8 `7 ]& h, Y/ n% ` R（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl) ] Z/ P; o- t9 `
无血清培养基。; W6 o" Z Z9 p' e3 C1 ^& w
（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入
& b B8 s: F1 E2 m9 h到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。! b2 [1 w2 ~# @
（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒
' m9 [7 S0 [, \4 U1 U) G+ k6 W溶液。放入培养箱培养。
0 y% u& w2 p; G& r/ _（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。- c6 ]( I0 {8 n2 v, x7 t( _: d
（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
. D) L+ R- F. d6 |' C6 R5 R说明：
9 N7 D' Q: [0 ?; A l- A9 k6 c. S第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；
2 T: @% @: [( G. g7 Q( z6 ]8 J. g第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；
& j1 o, R6 ~' E9 Z/ z. [3 L第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；# Y" F5 _6 H, }& e! S
依次类推…3 {4 P9 ^4 n% _) y% ~8 i J* y* p
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；
) b$ P; B# j; a' {' ^第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；0 g* `& w# ^' e
7 B, Y5 N0 P1 H) t }# i四、结果
) p3 v1 ^" T. K% _" F" t
1 E" a% p# L7 |慢病毒滴度计算:4 V' `2 M% T) B/ s
根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个
# Q0 E, c: V E; L" G( a( C带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度9 Z/ J6 _" {# j: y* a$ P8 C
等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,
: |7 z1 s6 ?, q% R3 Y也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结3 w6 |! B( {% A% A/ Z1 K
果如下：0 {' Z# P" B, o4 G( f- H+ m) D
Oct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
0 O, D1 \* c+ Q1 w/ sSox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml6 p8 t7 c6 j7 @% @9 o( b$ Z% X" d
c-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
! J! W# _, t7 Z# z+ Q' kKlf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
