细胞培养操作经验

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细胞培养操作经验$ r* `6 @( n* h0 e  b
                                             
4 X6 F: ?* A, @! o1，注意无菌操作，配制培养液时尤为重要，并过滤除菌，实际上很多情况下生长不良是培养液的问题  x* ^% R# H5 b: F. x
2，如果贴壁不好最好用多聚赖氨酸（生长基质）外理培养瓶
0 k$ m1 V( f; q, `0 E  D3，细胞种植密度不要太低，因为细胞与细胞之间会发出促进相互生存的生长因子8 A, x1 M! s' m& ]0 C
4，注意及时更换培养液（培养液发黄，或者2-3天）
+ U" R! u5 J) a  D# \1 o5，传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好，毕竟那又是另一种环境
4 f" J# \8 N! a% _. t6，传代时先用少量培养液先培养3-5小时，然后再补足培养液，这样容易贴壁0 ]4 w/ ^" K6 M4 ~; Z! }# \
7，在养来之不易的细胞时，还是用一次性培养瓶为好，国产玻璃瓶实在不敢恭维，在这点上我有惨痛的教训。
/ r  l# e  e# g% t" b/ U8，细胞在新的环境里，初次传代时，最好对半换液，或1/3换液，让它有一个适应过程。: N8 @% E. R/ U! d
9，我认为，glutamin很重要，培养基在4度中放置2周左右，Glutamin就会降解，所以新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin。否则细胞生长受到影响。$ T4 V7 m  U* F! Q5 G/ D0 S
10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次。
, r9 ?# J8 E; ]11，贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能放置几天后颜色变紫.这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢钠导致了PH值的上升。你可以在使用之前松开瓶口，在CO2培养箱中孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的PH值(确定松开瓶口以保证气体交换).) r+ y/ Z) {3 J$ g# k: W
12,如果细胞培养基偶然被冻,你应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以使用,如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基.% ^+ B# Y( j$ t% h4 r8 g
13，当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%,血清蛋白会结合和灭活一些抗生素.在无血清培养条件下，抗生素不被灭活.可能对于细胞达到毒性水平.' ]' ~  p- c/ K# Q/ N
14,一旦你在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,你应该在两到三周内使用它.因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解.) W, [1 P# b! G8 m9 z
15，总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀。将会影响它的性能。( p! ^) [3 u( C" T+ ]* ~  e0 W2 Y: f
16,在进行传代培养时,我强烈推荐大家进行台盼蓝活性记数.操作者通常通过一个简单的稀释(1:4或1:2)进行传代,不进行活性检测,你可能接种比你认为的低的多的 浓度的细胞.这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长." s. s/ n* ^" U
17，在溶解的一周内使用贮存在4°C冰箱中的液体胰蛋白酶在4°C就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变的不稳定。! ~# [" M( k& g

( R! X4 A8 e: e- |+ ~. H& L: B                              培养基血清浓度" i( w' c& c7 E& `+ i2 P* L
   
. O7 F, F" N, K# o+ {5 h   关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
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" q0 h( n1 S5 J# s  D- }                               污染的处理. U' o8 N5 t! `) e; f
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污染现象：$ _9 ~2 ?% k. l) k  g! G  |! B: b% j
    细胞培养中的黑色小颗粒，高倍镜下可见活动，大多被细胞盖住，也有附着于细胞表面，消化传代较明显，一般几天内对细胞生长影响不大，培养液不浑浊，可以肯定是支原体污染。因其与细胞竞争营养，长时间对细胞生长有影响。
/ N$ r6 r' B" w" v0 B) T解决办法：9 j" h+ e8 H; y% y+ g# l- n# q9 T
1、扔掉细胞
6 W  |: s: V. Z* c, |7 a2、支原体不耐高温，55度5分钟，45度15~30分钟可干掉它，我试过55度，结果细胞也玩完了。要试此法就看你的细胞能否高温作业了( @9 K1 H6 w' X+ S/ z/ Z5 C$ g
3、支原体无细胞壁，许多抗生素无效。四环素、红霉素也许行，没试过" U9 Z9 Y; n& u6 y( w6 F
4、有战友说Tylosin（泰乐菌素 sigma）能行，没试过，准备试) o. Z- W  i1 M, }- r0 ~! ?+ W
5、M-Plasmocin （Invivogen），看了一下介绍，据说效果很好，晶美有卖，就是有点贵。0 r) _8 U+ Z! v" v& ]8 v

3 R; j2 t$ s2 E; H3 n  G' C培养箱的污染：一般与水无关，应该是过滤膜的问题！
$ p% A% {' W8 q. W前提是水盘中应该在蒸馏水中加入硫酸铜，加量为饱和为止；; R$ K/ U/ U  ?! X2 W, ^
具体可参考，培养箱的操作说明！！！！# h! ?' O( `- @  n2 O

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8 K0 X' S, b6 j

ljs

这个是好东西

maomaoma

楼主总结得好，辛苦了！

xiangchou812

不知大家认同细胞操作经验中的第五条不，“传代不要急，待完全长满出现接触性生长抑制后再传代比较好”。我0-90觉得等到长满了，细胞很容易就会开始老化，出现一些小的颗粒。长到超过90%就可以传代了吧？

franty

回复 xiangchou812 的帖子7 X; u& R) Z7 d+ l

. O6 s+ ]5 U: }( L0 Q同楼主一样，我的ADSC也很容易就老化，我一般在每隔24h观察细胞时，发现细胞长到80%时，再过24h看时细胞已长满，然后传代。不知道细胞从80%到90%再到长满需要多长时间，也许做个生长曲线能解决问题？

franty

第9条“新解冻的培养基或4度中放置超过2周的培养基中都要补充Glutamin”，请教楼主，对于在4度放置超过2周的D/F12培养基要补充的Glutamin浓度？

luomeiwuhen

顶一个，谢谢！

dandan9230

细胞养着养着就会多一些颗粒，是老了吗？我遇到过，不知道是什么原因

mayuan3012

“10,若细胞不好养，在传代时注意消化液的影响，可考虑消化后用PBS洗涤一次”
- |( e3 x& W, p6 O4 W& T! u6 s消化后细胞都起来了怎么用PBS洗呢？是要离心吗？