又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

3 `& G0 \5 O  n, ?
& o4 i5 x; P3 s. s# }$ i0 x& J在此省略实验试剂和仪器设备步骤  Y. y! T( R: E/ ^! Y/ r! R' K
成纤维细胞的制备+ c: Q& G9 @- q
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies7 q5 D% d8 L# m7 i/ T7 q; E4 i
A 时间：15d4 E: e" X1 _7 X6 S- o4 A  [
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。; v5 N: l  ^+ A" ]) E
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除# S  K" p4 t% N$ c" i5 R* N" P
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
8 ^6 s& [- r( ]$ ~（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min ) @) H; e5 u' h8 L# S6 G! N
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
9 V" O% `# n/ x9 a9 T: q3 R+ k（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。  a, W3 h, H! r- r8 y5 m' B" I
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
+ N+ k4 H/ v* u3 n4 T" i9 [) n# a（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。8 p5 R/ `% a% s% c
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
& [& o; y$ D8 m# R% b% L( ?& Q0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。+ F3 m: Y7 H+ }6 g, @

4 f( G' H7 I; p7 g7 H: T0 l- e( R尾尖（B）时间：10d4 @- O1 \6 |. J5 U  J$ \( c
在此略; {. o' D; P6 U5 L
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
: M: x8 V0 R) U9 ^1 T; _（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中, x9 O) C: G0 \/ i4 Z9 J  |  Y
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
1 E1 k/ g& r- w3 ?（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）; `( o- L9 W+ r7 M  H
（4）        160g 离心5 min，弃上清6 L% b8 g9 t2 o3 a
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
. z" p9 o1 I8 |# [, b1 C孵育，直到达到80–90%汇合  [$ u7 b8 G6 s% H" L* M$ A* h

+ X8 F/ ?; ~6 t& l# g" H9 _* jCRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。. I: i) }- \2 g3 d( D6 w0 P2 C
5 L$ F" }4 P: a# ]4 r" `+ |; _4 A4 j& r
SNL cells的传代 time：0.5h
8 Q3 V( l. A$ O（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
; `9 v4 X$ v( R4 E3 Q) u（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
2 c6 [& j; K  }$ v（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
# N* `: }6 d% A( ^- {（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
! ~+ U. J% A0 S. l( f2 p. s0 N) R' m* {# U% |) K% D
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
/ R" P% }1 D& g1 A' F) O& h（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
; [; N! ]- Y+ n（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。2 r; a8 |7 n' O, e, i7 K& Y, r
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
0 B" ]# v8 Y# x7 V( r4 Q3 V/ o: k（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
# J6 b1 p9 h: u( P（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.; p7 [* t$ u6 P* K' y- b; }' [- l
PAUSE POINT  j1 [& r8 i; a% K1 \& M: j3 O  O
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周; }# i$ I3 u4 H

( h+ X) j3 Q9 x0 U  v* t2 k3 C0 A解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
* c5 X2 m- N  q（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中. A8 P- |2 p7 l" @1 r, z. L1 @
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）( ]7 Y1 z0 U" Q
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）+ Y% N5 o6 g; j! G
（4）        160g 离心5 min，弃上清6 M0 Z7 |) C; s) k, n: H
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育* ?+ g2 E  o" M; w# g
（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合, ?; p! W' z& |; M5 ~7 O0 X+ k' P

! f. |; j( A, ~) N- W- r" KPlat-E cells传代  TIMING  0.5h  X' L2 F8 `1 M
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
1 X5 r' w6 ^/ M% }（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合' k# ^0 ~# V5 w* e
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
7 H, K3 E' ~4 D. S  I* ^4 j（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min, ^8 V' b3 G9 H% q  K9 [
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S) ^, `3 z7 C2 C3 _
（3）        180g离心5min
, s( H1 N- Z2 A( p) U（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
  H: Y% c$ \7 M# i! X（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml, E  {' z9 z/ B7 w) E* t! k! p
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2/ P* b9 r: O( X; [$ a# u2 }
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
. f$ O; y3 L( o. x( h" }（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
: W4 b1 `) z5 N( E' j（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
. B" J2 r- a) p  p（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
8 Q* \4 E8 Q  O% N) Q) m（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
, b" v; @4 m/ ~1 V0 Z# ~$ H
6 X  J' _$ B3 d; Q关键步骤
" H) L  [4 ~5 C, G  @, m# YAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
! E9 e- l& @: J) ~: t: n) b1 |( z+ e" p! v4 v
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
; a; F7 ?; F! P吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator- o; R. T1 ^6 \+ `+ ?
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h
, p! g* g0 q& a: G* B（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
6 W% ]2 z" [- H' |（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗
. I" I  S- F9 i/ ~1 X（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
+ t# Z4 M0 H! M  t3 T: |9 p: f. T（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
1 T' K6 r* U: F1 l3 a1 D& t" k（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。! b% ?; T& N, E8 `
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h1 a. l6 d7 Y4 {
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
2 f7 B, r! N0 c2 h8 `* r( w3 B（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
7 x5 ?& z; p6 T) n" p. y* a（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
) H4 W6 \# D( [$ f5 z- [关键步骤
, G: j: W" z! l/ Z5 q0 E6 t9 |2 S# MRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度3 f- n$ `4 x5 S
- q4 S: d# @7 R" m
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
+ ^0 Z, w' Z/ A# ?8 V- K& C( \. x
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day
9 K  p) g% q/ D: M5 B24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS! i2 I2 n# ~. {3 o. F2 @4 p
Day 7   TIMING  5 min
/ {% a8 c- F* z弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
) v3 R1 b- K1 zDay 8–10   TIMING 5 min each day
+ B2 M' o1 Z8 q' h每天更换培养基（分别在24,48,72h后）& A5 c$ {" z) x$ c
Day 11   TIMING 5 min
7 t" Z8 t/ B. V3 b1 d% n For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
% q: R. v* ~2 O% Z! GDay 12   TIMING 约5 min each day; e& B, x! k( s' V$ ]6 i
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）0 J- Z$ Z2 [! a. `9 a) P
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
0 J) k  u7 @+ p* C（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min6 ^& f. h5 J* f* ]1 J' j
（2）        Wash the dishes twice with water.  n$ ?9 |) |5 b4 t9 [# g1 X& q
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min/ {8 R& i5 _9 T9 i" x4 w' g
（4）        Wash the dishes with water
- e( R. {2 }! o& v（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.. D, |7 u, J2 N
. X, p2 D$ J3 z' d. p1 f5 `
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h9 @) _7 l% u- |0 l; K( ?$ S0 \
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞+ P$ n* @, x' b. g" ?" o4 G" {
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
0 }+ z; N7 K* S/ Y" |（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
* u  {/ s; E8 d3 A  c( Y: K# S（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
8 h1 h1 h  N9 u8 h$ c# f9 y9 }Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
, p1 m* n! x. }$ x（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗4 O% J3 ]9 R+ e0 C# d
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
( H$ F9 F2 f  ~0 O: I+ r# F（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层4 c7 Q* E% _& E* S
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
* M6 X/ s2 k, F) {, K; p, N* e  U, Y（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
! @5 w( U5 q* N4 G& I（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
, n$ B, w' R2 y2 @（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
; D3 H) w, {  g（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
( C2 G- A6 s. M, kPAUSE POINT" K- S  Y2 W' @# v( d  B/ i) }
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
  q! w, [! T8 }1 P# m0 v4 g

sunny2829

什么时候的呀？？5 G8 p. M1 \3 b* V4 f) r$ Q4 P

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子/ l& A) K. k- U

1 l+ L" Y6 X) g* |这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子* L6 I, n0 J8 W2 f: T

! B; I# D$ T  E* o呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。( q1 H" O/ }7 R; [8 s# j
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？& M0 g: c: s* o+ ]
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。0 b8 _7 p& F9 N7 i/ |
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？/ ^, u& I0 H- _$ z8 h( e
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子; ^) j) \% A# ~; N9 L
) e/ M- a- E; K- D5 ?; k
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是) e0 T  ?+ ~# c) Q! X: _
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是: o' A  `! h& I* V1 M. M
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
3 ~2 |7 w5 L- U/ L- G+ ?最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子  L" t+ w% I/ l2 g/ j3 E  f. }

5 H; `( W  B" z! f2 U* g2 r+ C) o太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子8 m2 G  Y4 e% L" }, z. s/ b4 c
4 k% ]% k4 c  p( o/ C
没事，相互帮助嘛