又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

, o2 p5 V3 l. \# Z
: U- q: R& b4 h
在此省略实验试剂和仪器设备步骤# R: M% }+ C1 y' ~
成纤维细胞的制备/ m' q) D' T+ m+ [" K
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
9 [- J8 B' ]' IA 时间：15d
& S: }! ^" o1 s# p8 i（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
) Q  ^$ u  L: k（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
2 ^, u/ l1 g  F$ _（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 6 E: H$ v$ g, o) M. H
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
6 ~# w/ d/ T# i  r8 m# X2 G（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开, q8 Z! t3 G$ O- R  u
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。# y" u$ K& d/ n- o
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)- k) s: M0 Q, x4 Z3 u- D
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
% C8 A$ t. j# J' T4 d  I9 F（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
5 v) P7 ~0 i: ?; Y, H+ X$ J3 x6 T0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
4 L8 |  v' y8 @6 K6 L
! h  Y) h) `9 k尾尖（B）时间：10d: Y. l; n# J9 i. w! `2 i; ^
在此略4 z) k, o6 l: \$ F9 f* y$ Y
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
: ]8 [( g* B5 D, J0 U! e0 A（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
. [! x" l9 I% ~' i2 b) ?" C$ e（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）0 u4 R5 ~0 N& [+ r, B4 m  I* u
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）% Z! y4 [& F8 A
（4）        160g 离心5 min，弃上清  C% {" N5 v5 Z
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
0 j5 V0 {* m; E- W& X孵育，直到达到80–90%汇合- u; W/ T- b. `# \' Y( i% Z1 I

. L5 s  v# u! ^( H+ yCRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。, t2 |& q7 _5 g1 Y3 f7 d

% |4 ^% x3 p9 h, s2 tSNL cells的传代 time：0.5h0 s6 `, s9 d' f& z! B
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次2 w' q5 j7 X! {( }7 k6 Q
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min- E# k3 z- I) H0 h, R: H+ B, Q
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞. X3 O) E& }5 {: w
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
; c& N7 x) b  S& Z3 T  v: L; v% S! r# T' Z
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
: Q0 T: x  ]' I（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1/ A* R  o' A4 U- X/ H" Y
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。0 {: z/ h7 k# T: _0 d! R0 R
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
" S  z1 w8 b9 z+ h4 }（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)# Z& R% C1 M8 C1 {' F& @
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.& K8 K' \% C, y5 V9 o7 u( ]
PAUSE POINT; J. [* E% R- c) N& C, X! O' @
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周; g( c. V6 T9 l6 K2 Y6 @7 Z; ?" l

- M8 l& B( Q. F- t& d解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
. w0 r6 \! x7 e5 @. V. s0 \（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
. o7 r7 m$ ]& }- L  U（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
9 M7 h/ Z% {5 L# k( b（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
4 i, c/ _7 H+ u5 ~% s（4）        160g 离心5 min，弃上清
- B- w6 P4 {% }; r（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
$ V9 x  x6 a$ k$ q8 y, b（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
2 x+ ~  I& @8 v
0 o, D$ v/ I6 o% d; \; gPlat-E cells传代  TIMING  0.5h6 _/ W/ S# M1 ]2 `8 h5 Q5 @  J! t: _8 C
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
, l. t6 }9 t4 k（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
# X3 Q; q- U0 W3 `/ U. q5 Z! MDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h: i' @+ l' m: l+ f
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min$ ?# j1 x( N* T5 S. X) s
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
9 r$ s# A% g* @: [（3）        180g离心5min
; r. O2 L: l8 \& O（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
. O- l4 v6 p8 Z（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml% U" W0 H* c' b7 `
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2& f% W) h2 |4 C
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
" u: J: Z4 ]) c* ^/ f+ e; {0 r（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
, C# B0 b4 Z9 E' m$ Z（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
$ N, X$ `& p$ r- \( o' F6 v（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min9 W9 H- U( T3 R% \- K) U8 A- l4 l
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
( ?( a4 d) Z9 p) `+ H! B! _# ^& Q0 k9 Y! x3 Q2 k( a5 U- U
关键步骤; y" w3 C& C4 l( P9 V  J% j- Z
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction3 E5 R; Y- z3 H& J- K
: Y/ H9 B5 C8 g& _4 d
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h+ o0 o5 S% j: C) m! e' h
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator2 E! v$ B- A" P; r& `
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h4 J" V% e/ F& W" t! _) o
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
9 a6 @3 S1 V; [% t/ x（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗
1 A2 K% p4 Z6 |& Q2 K（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
5 y0 R$ [0 y; d9 R' {( U（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中0 i3 D1 a' J% s$ }$ u) q
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。9 T% ?7 j" w! R: p
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h& W7 g6 e- _* f
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。# f" \$ u. q& H2 L
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
3 c3 Q  |1 k" W2 R2 O: h（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.; c. E1 u7 x2 v* F2 i' \
关键步骤
# ]3 t' p, a( t! [' E( E1 ARetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度1 @9 Z+ l$ F+ x% U+ e: c1 R3 L; o
+ `" _$ V- z$ \+ B4 j) |& |
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
7 z  {3 j- _, |" q* C. S
. V+ Z2 G! N0 F  KDay 5 and 6  TIMING  5 min each day+ Q: }0 e+ n: e) O
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS  |& E( o0 r) A: V2 ?0 |! `
Day 7   TIMING  5 min
9 t% g' {4 Z0 \" J0 @) }% Z- A4 u2 t弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G4187 q# T8 W8 z) e5 {& P
Day 8–10   TIMING 5 min each day8 g4 c; T6 K8 v" @* [/ P
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
& t1 y) q3 F' Y" Z. x' S% PDay 11   TIMING 5 min
- i2 j1 \1 V3 t8 b For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
6 q- X4 \  `9 O  y; C8 H2 YDay 12   TIMING 约5 min each day
! M7 f& h2 o+ d  Y每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
" S. I- v4 ]& o1 K3 @Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d% T' a3 T; K( e. ]8 Q
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
" p9 C$ Z/ z# t（2）        Wash the dishes twice with water.
& y* F& Y; U: H9 u& W（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
3 R7 _- h" r, O7 j  c1 a2 {3 W3 _0 W! Y（4）        Wash the dishes with water  Y( r* [% y" y% m) L, F7 [
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
' E; v5 ]6 [$ I$ |$ b4 _
% g9 p0 g: }6 D1 c9 C) K& F" }% ^6 K# Q, aExpansion of iPS cells  TIMING 1 h
% w' \  g8 ?0 f) Q! f  n（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
  o1 Z8 G) g2 z（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min7 D. A+ D/ R8 P* R* ]6 i
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
7 S% O$ K- _2 t- k: Q' K% l0 n（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）! `* |) R# Q$ {( {2 i1 \8 C3 ]% Q
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h( _6 r3 O, O: o7 X
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
5 E& Y9 j' U' b6 N（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min4 t4 a% m* g! S
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层1 P' h1 n: V; ]: z& ?
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min9 x- h# F2 _( ?8 ~
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
6 `, r! t& |( F$ F（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
) C( Y" P/ {9 k% e0 c0 O（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀) t1 F: V6 ?; f& S! y( v$ l: v
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
4 z& _& d4 Y. Z" KPAUSE POINT
( ?9 y& s! T* w9 m2 \* eFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.- Q0 ^1 |, s! g: u4 V) g) Z

sunny2829

什么时候的呀？？
: N2 G1 }: \- v: e* V

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子' s0 @* }1 Z' w; f
/ j' M) {) s9 l  R  t* x/ F
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
3 q6 L* R1 U$ l8 u/ B2 ^' J
) s* J$ x0 Q/ L) K% ~2 q呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。- n. O( b: A( l" Q. Y, B
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？9 l9 q& X, u( i# ^8 Q9 m6 v/ P1 r
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
. A7 u9 h; j# o" _这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
8 n1 i$ N# ~5 c9 R$ Q  s+ D- W" {新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
) A: C! K4 D5 @( a. Y$ c( A6 u# D7 H- e0 U& ]
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
# u7 P  B0 N; O; t1 {0 b2 g! K首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是
& p1 M* h8 |& t3 S9 u然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
; `% U- B7 m: ]0 C' k& M2 }- J最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子0 z' e, U* [4 z+ {" C1 j) X" v

+ `; L5 T/ L! y8 s: t0 ~太感谢啦！！

huangcong1988

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: D0 Y) n: d" `4 F0 J  d2 ~; N$ V
6 I( o' U& I: K没事，相互帮助嘛