|
- 积分
- 2917
- 威望
- 2917
- 包包
- 6530
|
 
本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 6 L& B# y, V& S5 I3 l9 j
0 I$ E# H( N* u; T! A$ o在此省略实验试剂和仪器设备步骤
- |: u/ f$ d3 E成纤维细胞的制备$ z, {: w4 c8 f* m3 }: Q8 K( ~
1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
1 L A' f# V: ?; C( tA 时间：15d
0 d3 e) D( `. b" d/ t: N（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。7 B- b' Z# R0 f0 \9 R
（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
+ r1 d2 W& ~: H（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
' e1 t% x r; m5 M0 u$ C- R; a（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
8 f2 o1 ?( c5 p, u5 R" Y& }2 \$ k( T（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开. V; X( h, w/ L d2 |3 M! v7 j9 ~
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。, U4 s, V: ]) q# p3 d& G, J4 |) K
（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
D& E$ K: U+ M6 ]; p. w* `（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
! a* q3 q" H4 W$ t（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and% s5 v' y5 N7 Y/ ?- G7 a- x% x
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
& |, k: f! K# g! Z: z% ]2 o# u& Y
& ^. v# [- P, P# V' i1 L, T尾尖（B）时间：10d; e9 \, @4 r% ]5 ~+ e
在此略
- t, Y/ c$ F; ^9 S/ S, m: W解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
# Y! g5 U# [2 |（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
& h3 `: p1 H3 h$ [2 B（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）/ z; o6 m' K. X& |, C' o6 B: m
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1） K# R4 e& i( n; y
（4） 160g 离心5 min，弃上清. k* M& M5 j$ R5 e+ R( D6 [* a
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
0 _4 ^* q% x1 }: e孵育，直到达到80–90%汇合' F. ^; G7 e: w, k T
; Z3 V. M# \4 g( a2 g5 ?' K3 h
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
) {0 k5 Q8 Z7 i- I3 f' L4 t1 P0 a: n" ] p4 b/ V9 }. j- [0 g1 t; \ }
SNL cells的传代 time：0.5h. M5 z* f0 U" {: q9 ?& K3 Y; l; P! f
（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
9 Y! V) K. \$ W( ]7 P) J（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
k7 q0 I+ P8 [& O（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
n$ X8 Q0 y# U（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage; w$ f% |' K( s* D! v. O# \
: S" n2 f( A* E) e# I
Mitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h
( w* q, A2 ?* f; z& @- H; A（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
) P2 e# a4 q3 m1 K9 P（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。( a" f8 e$ f ~" h4 H$ e
（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
' F/ H( x3 k# G* w& Y- B8 p) L2 F（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)5 n' o; K) Y) P" ?
（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
, n0 W- R6 }) ~# APAUSE POINT
- k: V6 a; Y9 D! q" q2 vThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周0 }, z- ~; x6 q
$ q7 b5 T3 J' e+ \; Q解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）7 p: f& }0 }' n2 d: L) n
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中" k$ ~- L; V: o
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
* ]' B: l* V& q, c: a; j; |（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）5 i# F% v8 t8 G/ F, R0 K1 g
（4） 160g 离心5 min，弃上清3 M( L) n4 o1 \- B
（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
* [) Q- X, u0 k4 A6 }& e$ H T# d（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
+ R- F6 `+ O0 z5 c( E; D! L
1 @, e1 B! U1 ^( h0 J% c$ YPlat-E cells传代 TIMING 0.5h
# h5 c8 {7 z/ S. e3 s（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
( w& B$ N: `2 O1 Y- R（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
f6 c. D1 W( E* S7 IDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h4 Y' n) E2 l+ f3 _# s
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
r& T+ {+ {1 u" ]9 M6 c（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
: ^% a* c0 s5 W s0 l6 I（3） 180g离心5min: J `* }. _3 f a) k0 _. @. Y
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮2 Q- _; N, B% M5 A4 S; }
（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
1 b0 E; L( b) X! V- V（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2) q. O# g( l$ D( {' r0 H, {
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h$ ^" l% j' ?, [3 Q8 P8 n
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
( {8 l' t, F- G4 i! y# y9 t（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min2 f7 G1 C* o2 X0 f2 k! Z! ]
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
: L# ^2 ?4 ], h0 J（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜3 F, k" | }; k/ Z P; C+ D
& N# d8 Z/ @ z% Z2 K9 ` n9 v关键步骤% w! a) H4 h: d% o0 ~# N7 q
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
& C$ ]' |$ q9 h8 |) b5 O. j/ g; c" {5 E P4 C9 F# v, j
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h0 }$ C8 @3 C! u- x% {7 b
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator+ _3 V" z) q/ n: w' J5 z
Preparation of fibroblasts TIMING 1 h+ v5 E- L! c& x
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）8 E1 i% ]1 M" I+ d, O u
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗4 t: h `; }+ H) \$ \ Y3 K6 a( t8 G; X
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
I5 |- B/ }8 `6 r( Y" ]/ Y（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中. E0 t1 t# @% w0 z
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
' \+ P3 f' \& W K2 X+ NDay 4: retroviral infection TIMING 0.5 h$ O0 c/ h; j5 E$ A% B1 w- v
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。" t% C3 ~ v6 }: S# k' C# r \- D
（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1! D, f* K: F5 \. Z6 r: E" q0 J/ A- k
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
% O4 @* N7 Z Z# `4 s2 W; R关键步骤
* ~4 C1 L. ?8 |' FRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
( R S* \' X9 n8 ~# `: d) r' H6 d9 b0 [! g; X9 n+ m3 a
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜% Z! ^# S+ `7 c9 l3 L* w
! e; Z: [6 Z! z" z% P( p! o1 e
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day
$ [9 G! V- _1 A/ R24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS6 y4 S* l" j' d* x- z
Day 7 TIMING 5 min, f% g1 s. N& z; T7 B" U% c# C1 f; ~
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418 U' r7 K3 u5 X% [# E4 y- c% ^
Day 8–10 TIMING 5 min each day
) L: j; P5 v2 ~( j3 y! k每天更换培养基（分别在24,48,72h后）0 m! w6 L+ Z- V9 r6 ?
Day 11 TIMING 5 min
w+ O% C! @/ @$ s% o For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–12 @5 q+ B2 U$ A7 K4 V
Day 12 TIMING 约5 min each day) T( X/ m3 ~( s+ h( z# G
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
3 _) H& R, J. E, YCounting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d6 B0 Y& {) g3 ]: a% N3 }- V
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min1 \9 X$ K( F: g m: a1 N9 V; T
（2） Wash the dishes twice with water." S* F7 U8 b( V0 ?5 |5 W
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
5 u; k* y! H: I3 L! B: V（4） Wash the dishes with water k% i# ~ o% t% ?, Y
（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.
0 G& u' X7 |. E* ]/ {% `' i0 S
: ]+ I% ~$ j( l# Q8 _9 MExpansion of iPS cells TIMING 1 h
" J* g' C$ p: I! l3 T2 X（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
1 C7 n5 [3 C6 N（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
# e9 t; Y% u1 N& B" X) |+ S1 Y（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层% \: Y2 x9 u- K. O
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
9 ^/ o2 J! c4 N% O1 A, [3 rPreparation of freeze stock TIMING 1 h
: p2 l9 r+ T, y% t/ n% I+ L（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
! V1 p$ `) v" z3 I4 c（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min6 \2 i( N3 M5 Q/ {# Z
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
' c5 u% b- X' k Y; C（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
5 j5 c, }, n5 y, V* f（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
7 {) Y( E7 T* \& h" ^（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）& X) U/ }8 l! x6 R. `* S% n( N% i
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
, I" i) l' c- C; L) n（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）8 p+ X% k9 e8 E' g! X6 [+ \5 G
PAUSE POINT
! _ s1 ]/ q& I3 j+ L; uFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
0 |% @( G4 E) \% Z( d |
附件: 你需要登录才可以下载或查看附件。没有帐号？注册
-
总评分: 威望 + 50
包包 + 100
查看全部评分
|
发表于 2011-6-10 09:06
