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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑 + r) o7 k6 B' Y5 Z/ B
2 z5 Y/ z* u2 O8 n
在此省略实验试剂和仪器设备步骤8 {; M6 y* O9 Z/ U7 W
成纤维细胞的制备
( V2 I0 X" K* Z" X) U! P1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies( B6 T/ _' v* [4 m. X
A 时间：15d j! X$ X+ @$ n& z
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
, q4 e$ Z. y( x（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
" X+ q D+ Z' R* N \) A（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
9 F% Y( N4 g5 ?; r6 j+ u（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
5 N' ^! R ` X& Q" Z4 r2 E（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开- r1 L' _( S2 `9 J U( k$ _
（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
7 F1 e0 A [, R4 c（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1), v0 F) K. k5 W' D0 X
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。 Q3 `5 |' l) h; s6 M
（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
' A$ h7 k3 f) f+ \3 b) F9 R0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。9 R- E2 q, ~' i8 A7 u4 `! b
' N: `7 |% h$ a& L; H, ]
尾尖（B）时间：10d0 s6 U3 V9 x# b9 Z) G
在此略# e* ?7 H1 B& S3 h: h9 h) l/ e
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h5 v; `7 r2 J; n" _7 [( n1 d% }; y
（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
6 [: m' z# [6 a u（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）9 W/ m' b5 B2 a' X' m
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）0 R% U2 q) U4 J- W% f1 j" h
（4） 160g 离心5 min，弃上清
! I" b. W0 u% o- H# M# \7 R（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2/ |) J, G/ F" Y
孵育，直到达到80–90%汇合; N. E, q- j2 Y$ Y# K u9 N9 \- {
3 ^2 ?$ ~" w- I; a2 y6 e
CRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。& s( s1 I$ e! M/ n+ H& o6 }7 B! k" P# b
9 V: S2 j1 r1 s' a7 K2 u1 S
SNL cells的传代 time：0.5h
( r9 f* Q' W+ T B（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次' S o) {# w# c
（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min: ^* E& i0 C& S# i4 F. }* G
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
# f: T7 @, d3 S! X( \9 m（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage3 Z6 R S2 d1 t$ \% b
. l1 [% P- Z" ]( _% ~5 L, WMitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h8 z; F W8 E& J/ X% C0 {8 \
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–14 F, m& S' }. T6 Z
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
5 d4 T; N, y+ |2 \. N（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min/ D" \; p- E* E! f' v3 ~7 @
（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
! b# {) D; [ w: y f3 M（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
) d/ z; _) ]$ @* H2 yPAUSE POINT
/ G' n# y+ R6 [+ v% P: U" a, RThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
+ k% ~& }: c1 D/ ?
1 Y1 d3 C% W5 Y" k% _解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
$ t0 N% U$ c3 W7 T（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中* k( l1 Y5 P8 U0 V
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）& G8 U! Y$ W* w2 k1 k1 d
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）7 T0 t3 a. @1 ~# v6 x* j6 D8 `
（4） 160g 离心5 min，弃上清2 W0 S+ N+ s' i& L
（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育) g1 [& w- m& A3 H" j; }6 ?/ @
（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
: l0 Y: ?# Q! L1 F
; B$ h- b) f2 Y7 t: ?8 V& `( g( _' UPlat-E cells传代 TIMING 0.5h9 b3 e* R5 e' k* d2 H$ l* t
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清% B7 ]$ n. e0 K7 `6 o/ H
（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
: D+ a( O- @. E) z- X& fDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h
4 R0 `% y' Y0 R7 U) f Q（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
& L( e8 U& k4 y4 g$ o$ k. e0 ~ N. T) J（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S. T" l& x% x3 L9 |+ t* s+ N: {
（3） 180g离心5min
, C4 M/ {/ c7 K8 {% q6 V' ~（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
+ s9 L) x. U( `0 T! ]8 a（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
, e ~$ W: F0 V" o（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
7 L. k' }& s' ~' n% b; f" D. PDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h5 g9 q; d: | J) V
（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube' I: g' X- r5 O) i
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
" D" D' B n! h2 ?* q（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min, |- S8 i/ {4 @3 q8 v* S' p
（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
: z( j# e( W5 ]" t3 c! W- ~/ c Y
关键步骤
$ P. d4 z T8 y, x' A" [Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
; j3 A$ o; h& l$ V! H! ?3 q9 S% y5 O1 d) C$ h2 E8 I4 }
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h# ]) z# r6 p: u) H& n a/ o
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
( }% H* ]! ~- |3 p- CPreparation of fibroblasts TIMING 1 h
' P* r4 R" t: e2 b8 l（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）7 J* y3 G# v) _3 L: @. U- _' l
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗
" c4 N5 Q0 H* y8 V0 P（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
9 T2 D" t& ~: U2 H) p4 I（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中/ V! S+ K5 O' Z1 w5 r7 L' E1 U
（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。; U7 v5 Q4 s2 s* K" S6 c0 x5 J5 j) r
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h, d, g' _& Q+ ^1 V
（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
! Z# O$ K2 K3 q, p) f& Y- @- Y（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
3 B( o+ B: F) c! ?+ D2 K; ~（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
1 ^( X2 \2 D1 d) V" N t4 Q) _$ |8 b关键步骤
3 @# ^2 w* w8 A- CRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度# b O7 W2 H1 d: O& T- n! P8 o
, S5 C' o$ U7 Q9 b$ h3 W: O
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
* i$ d: x3 s8 N9 T" ^; e; C, q
8 j, K* c: v3 |3 i8 x) ^Day 5 and 6 TIMING 5 min each day7 V+ y$ ]0 U2 r* f) u; I/ l/ E
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
* e$ y m6 i: q# u4 z( m" |2 sDay 7 TIMING 5 min1 M! B k+ ~+ ?. c
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418- j/ ^0 H, j' r1 f8 {. l
Day 8–10 TIMING 5 min each day/ S* w+ W* ?' a; _# c
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）% c) X& P x! ^# ]
Day 11 TIMING 5 min
r1 d1 h! {5 Z" n; I For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1 z7 ~$ b+ E4 e, r
Day 12 TIMING 约5 min each day. V/ o( [, D9 F
每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
( G! D& T5 ~! H v0 u1 LCounting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d0 z$ o8 ]8 Q7 t6 V' ?. W( X& x+ f) J
（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min6 b! ^ ^' \& r& l# I; z
（2） Wash the dishes twice with water.) g1 k* U8 B3 ~7 B; \% z2 v
（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
( ?0 d5 V4 y6 X* q（4） Wash the dishes with water
! B- E* _+ H2 C4 y（5） Photograph the dishes and count the number of colonies.# j- y5 B& q+ j9 r
+ }( `( ?3 j( C
Expansion of iPS cells TIMING 1 h6 I3 D% K" Y- u
（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞9 v! ~+ x. B6 Y* S, v- `3 s
（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min/ P6 c4 {/ {. n' Z2 D$ Y5 r
（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层# K7 D6 ~' T2 |2 O/ f8 W- b5 V
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）/ J: ^) J9 l5 R
Preparation of freeze stock TIMING 1 h
3 c1 q4 A3 y: I5 e1 }% ]（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗8 i* I6 v, f- M! e. W
（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
) l$ z" U6 {5 B2 e- \; C（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层: [1 B8 P o: a/ Z
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
* K. _* l- ]7 ?8 `/ f; g（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
6 @! a2 B5 y$ r! |（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）- L! D9 f6 F2 U& j; Q
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀5 D2 B7 ^! a3 j. N6 w
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）% t5 M. i0 s2 p2 e& m) [
PAUSE POINT# Y1 t' U9 p/ [' j
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.- w: p; Z R, o1 M, k
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发表于 2011-6-10 09:06
