又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

& {1 Z. n/ z' x0 h) P

# a% o1 w" [1 W8 a" N3 u: m在此省略实验试剂和仪器设备步骤' N- h% x* t# A. L
成纤维细胞的制备
+ ^+ [' w( d, @1 r% z9 a1 w. U1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies4 \( ~8 ^4 i2 P. C
A 时间：15d
/ e* j7 `& C6 v" n& g（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。+ S5 y9 b: o1 g$ w! {9 Y  d; Z, V
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
* s: }2 I+ J; j, M( V2 ]4 m（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
" L/ U. l9 w! T（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
9 E6 Y3 M- l1 h7 `（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
6 T5 G. H/ I* G/ Y9 i" i( O（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。& j% y/ d( `9 s" R5 V
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
* A6 E: K# q/ @（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
6 U  c  Y4 f' ~5 t1 C（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and  O! ~+ t$ E2 g
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
" C& f# u6 Z5 V) w3 v
5 C; Y: \# \9 ?  Z尾尖（B）时间：10d; l4 l9 `5 M, T' H& l
在此略
0 l0 F' W. ^. c& Y3 r解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
8 D9 a& ?: S# J$ B& d6 w6 z  Y（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
8 N0 Q, y7 N0 {3 @0 e: ~! I（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）; G# Y$ R+ p% J' H4 ~# [
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
1 {3 ]+ D8 D5 E1 a# o（4）        160g 离心5 min，弃上清
" W5 v% ?8 t& t* G+ p3 A（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
7 a# v8 k, A9 ]0 |孵育，直到达到80–90%汇合8 B) @& V6 R( E# i1 L' b! |! {! Q9 l
3 ~( W0 {: q' b6 L7 s* ^
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
9 O- T9 n' \. `5 @* K; o  @5 {6 M, F# T2 `4 m
SNL cells的传代 time：0.5h3 M) c4 ^+ f$ w
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次- v5 k4 h; H! Y5 B5 p4 Y
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min7 _% V8 t9 a7 p7 e: \+ d. T" ]- }
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞5 g" b( ]4 d# E( I+ ~% F0 i
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
( B" t. o! W. C/ ?6 O  Q; D/ ~+ _" |- G* ^
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
6 V! Y* w2 \  p% u* w! e7 S5 P（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1- d# O4 O1 |+ _
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
) v& F' W" ~" m/ b9 K5 I（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
! V; A3 [; g1 t（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
! p) x. T. e; a" a  V8 |5 s* J（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
* t  }+ ~2 F) y# \" jPAUSE POINT
, v# g1 n7 N3 A# nThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周0 R3 r. n6 A" d; Q

$ ^" B( ^( a: q; T% W% h4 b解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）3 i! V9 `6 a% t/ ^+ P+ o2 O( N
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
% _: ^/ b3 l, m+ N3 s（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
) W& i( C" `% B$ V; W+ P（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
8 a7 E' i$ p- m4 J（4）        160g 离心5 min，弃上清
/ }( d! M" t3 {) u" \（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育6 T* C- _: i: F
（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合% m8 m7 t# L+ d3 H; D9 e
4 ]7 k8 ~( i; \( n$ r
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
5 p4 N- m3 d. C( `4 S1 y5 q' c（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清0 d) U" c' ?) h* K# }. {' a
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
/ P8 i  Y4 {, uDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
6 j  K* c$ M9 i- d$ A8 X, k2 W( u" K& Y（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min7 _$ Z0 }) c; \2 V/ B
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
. G$ x% V4 b  r( o( e& B! R+ ]( {（3）        180g离心5min
1 J  X$ V4 n2 z（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
4 A; U! i) T& f- T- t（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml' i! u' B1 Z2 v' `7 o# T
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
) G" C% |) T. {, s& `6 `Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
% w2 M9 q% E4 z7 |' b: q（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube# I6 n5 T0 S* W
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
9 s5 t2 e' b1 D! M（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
9 s) A/ H+ K6 F! h9 c7 k% A（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜+ C/ w& k! @- V: U5 R
6 `3 v% W% J' F; _
关键步骤0 i- U' o0 q; W! U$ n1 i7 r2 [
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction6 E2 J3 h* A$ I0 W2 k( a
6 W6 d, _6 E, l
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h, E% P. C5 J3 e6 g3 F! q
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
4 F& o$ y: J, R! I- jPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h
: \/ j( w8 e0 a2 [（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）. o1 ]: C# E# U0 i
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗5 ^) G& A( o9 c" k! v
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
" P9 }# E- y1 ~3 G) w（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
: q% g& G* t. [（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
4 _* U" w: u; S+ _: fDay 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h/ j/ \4 I- B( _( X& g/ a
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
3 N1 d% x2 w& D7 R, H（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1; q/ z- N# z0 y$ C9 M& [' k7 k( I
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
. h  P* _: s5 m, M- t% e关键步骤2 A9 s3 B; P8 I& }
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
7 r5 c. p( h: v1 h; H
7 o) {9 @1 U, W% n& Y7 q" F" U（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
( v7 E% s' a) T+ @! y& i: R. V% r0 g" T
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day
( u5 }6 x7 t# W5 R24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS, j1 G8 J+ E( F
Day 7   TIMING  5 min- |2 k; X2 Y% @- m5 W3 y
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
+ h  d8 U6 g  w3 m5 y: KDay 8–10   TIMING 5 min each day
$ W; g  o7 j$ J( I: j9 `每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
/ T! t6 E* @) |7 H) x3 J6 O3 oDay 11   TIMING 5 min
& Y% ?7 a, i# @0 M0 B7 w$ |! ^! F For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–14 [: q2 q3 w6 H! j  E8 f4 K
Day 12   TIMING 约5 min each day) r3 c3 g/ u8 k! d3 p" o
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）: b% m- E0 Z# O; |8 i
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d. Q; ~$ u) Y) n+ t
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min& S6 t, N7 g' D
（2）        Wash the dishes twice with water.
; K$ k% S+ L) c, N$ b（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
) Z; ?* c8 y; @% C, ]6 d（4）        Wash the dishes with water
6 U9 h* }1 D# j9 d* {0 {1 d（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.! e* x; X& d; Z) P+ X+ q# f0 g, P; V% P

# B1 R7 t8 j# E; p. yExpansion of iPS cells  TIMING 1 h1 q5 [0 N9 ~6 T) e# i
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
% }' C( p3 b2 b( T/ z（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
: }2 {3 h+ x: S- ^  ~* _（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
$ o( s- h5 G) d7 i/ j. k1 H（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
; o9 }% l, i8 B: B7 Y  o6 |; JPreparation of freeze stock   TIMING 1 h
  ?. n: W' s# D' m6 d（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
. @8 H1 b4 C% ^3 K! S4 A* |. r2 B. v（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
% b2 e9 u/ {; t/ V3 t8 K（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
/ {/ [% c* B* b6 g（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min, j6 }- @+ V! S. `- L
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
; Z+ B3 E1 q4 t. N# N& n' P（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）" x7 o5 e  B8 ]8 X
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀' w- R; S0 M0 G4 ^0 L0 q2 A
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
; h+ H0 B- D/ ~) V! T' F. WPAUSE POINT
) z2 k+ v4 w( VFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.7 j* G( F) y: ~! k0 }$ e

sunny2829

什么时候的呀？？6 h. H% ?. `' V3 F

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
% m6 [1 ?3 A, w$ _' J( i' ?; c1 `% Z/ @
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子6 H; `: O. i, h* c

. r# w7 A2 H/ w, G8 E  ~. F呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
" S1 x6 F8 d) h8 q+ M这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？* D$ e: U( i: f" c7 B
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
3 \5 A0 E$ @% u5 t( x" _' v) Q1 u这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？- c9 \6 ^$ ^/ d" p# q9 m
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
7 N* Y% h, V' n' Z/ [* K4 p4 W
. s; L" i2 z! w呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是8 B7 U4 G' f- U. Q( s5 l
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是
' T  b- H; I+ Z0 z0 d% M' M然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
4 h. m/ A, V6 f) M+ `0 r最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子4 }9 ?+ Y& c. N. }2 I7 e* h* b

! m0 [+ S* M$ ^+ z5 |1 [* o太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子, W2 `, Y5 G% g! a! @* t" U

' B! ?8 Z* U" b# Y没事，相互帮助嘛