又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

  K  f6 Y  t. H- ?- R
1 E" S% T/ |% H8 _. S$ ]
在此省略实验试剂和仪器设备步骤( l# {2 x5 {5 i
成纤维细胞的制备
$ T' K% u! P& U: W/ ?$ w1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
- l5 h' U+ y' v! J) hA 时间：15d& O6 j4 I% H+ u  a# s
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。. O9 L! k: z6 N2 S6 H( `
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除& M* }3 c( n9 V7 k: {
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min ! Q6 W  r: ?  E3 I
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min 9 |0 b6 h7 H: P
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开, a" S  |8 y" F
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
  _; L1 n7 a+ u' O6 T, s8 r% c（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)" s; P. v) ]: N* G
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。6 {5 e* y1 O+ O9 B0 \) B
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
% Q3 {! ]# f# ?0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
( d7 l2 c& K* p/ [7 R7 o4 C: @* O# C3 Y/ w( v6 Z
尾尖（B）时间：10d
2 A* ?! b3 `  `/ N$ j在此略
  c* R  J8 I5 n5 e- @解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h- I& u9 l7 t2 u$ H
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中* ^$ a0 n; Z5 Q) }7 y8 D
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
& Y; ^1 m& A! G  O（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
& H8 f; P) M! t1 U  M（4）        160g 离心5 min，弃上清: S5 O$ W6 P& A) S
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
# l0 a# c3 r0 p" o孵育，直到达到80–90%汇合$ W' P. O: p/ P) Y+ J) e. v

& K% m' ~" u: W' \+ i( |' ?CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
& x7 U* U3 g/ [/ p  W% G$ |0 N" r. L+ }. o! \
SNL cells的传代 time：0.5h
5 d7 T$ x9 Y, P; p3 x2 ^, J9 P4 Y（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次# q/ ^5 t$ V6 W
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min4 _4 N% `% @, f8 X; m
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞& _* ]4 }6 X' e* r4 y* g
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage/ L. c. P4 [7 m  j$ b3 i& ?* y
$ a  K; U2 T5 ]8 M' O
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
/ ~- I' f, K7 }8 h! Y（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–17 Q6 r1 Z& a" n; ^) A
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。0 B; m, c, D) y% P- i  |) e3 I4 r
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min, I) s$ r& \8 h+ g" V' i4 Y) W
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate); J" b! W2 r" x& h
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day., f: Q7 H! v) X0 a- p1 N7 E
PAUSE POINT
0 [$ _4 f' H$ `# n  OThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周$ E( R5 [6 c6 V# @& A7 z
5 S: M( R/ s/ |; }$ E
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）. Z# n) a. h) J4 c& V
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
' {- P% G; O* a! k  }0 G7 {（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
' ~/ n* v/ v* n6 A- o（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）. w6 f, r8 `) m9 Z7 u  Z) V
（4）        160g 离心5 min，弃上清0 u4 A& S/ z" K, F
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
" V+ X# R+ p7 _6 Y（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合8 z/ g) ~* x. p. v

4 Y6 ^1 A3 ?$ @0 T% [Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
; z. m9 m1 _8 d1 h, V7 o  @- p（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清! x! @8 u" U5 s' S+ @
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合/ q5 e6 J/ S- [. P7 W
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
) F2 l- n7 }& F（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
1 o. |: }! O! z6 A& S) ~（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
; |9 N2 z/ F- s# `. {（3）        180g离心5min2 F+ a! Z8 M; D( h7 l' |( \
（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
2 }* S+ u0 j4 i7 ]+ h; z8 u# O（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
' A5 @: |8 o% U（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2% ~: h/ @% o: q
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h9 q7 m9 Q9 k1 D( E" P
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
; {( {3 O; p+ I" j5 i/ s（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
; X' h, A% ?: ]（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min0 V8 b% @: M3 k, M
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜0 o/ z3 C1 B* Z" ~/ Y
3 l, u8 R+ v& t! B
关键步骤
# k; j4 S- [5 qAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
: c# Q+ }; v# i5 G: D- J+ |' p, e; a6 C# m% |! Y0 M3 z, `
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h" Q& g2 f3 ~3 V) a
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
/ t, f0 G! D+ K2 e/ b9 fPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h9 ~" @* J' N4 K" ?7 k7 m: W! \# [! \
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
+ F) M) n5 {( Z5 e% e# g3 H（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗* [( {" i- c' i5 r) I5 V
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
9 Y% J& h4 o! d; o（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中) N2 |. V! h$ ?+ v6 J0 J
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
. D( s3 E6 ^2 Y+ E- dDay 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
8 Q7 J$ b4 G/ [( H, N（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。# W% a: P' D, |, E
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–10 k' O+ s) W0 t3 ]4 v' O' i
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
, s! h: I3 n0 M  l* i关键步骤
" Z* n2 [+ R7 `; ^- ZRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
  M! D% i1 H. a, {* \2 d2 ^& ~" j4 Y7 e6 c: e: r
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜& L( c- y$ W2 X% J
  F0 T6 A6 }( y! J2 [) q; B
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day3 [3 |8 Q; Z5 f
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS. G8 K5 B3 V. s) t8 w0 a
Day 7   TIMING  5 min3 v4 M, U* D- G: a( d' R
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418! h3 {0 E2 C$ R2 u& R, y7 A
Day 8–10   TIMING 5 min each day
$ M* x0 d; V( d: A6 V$ H, n9 \每天更换培养基（分别在24,48,72h后）  g2 ]# h8 w; e8 ?( g5 l
Day 11   TIMING 5 min
; U9 |' u6 g/ _3 E" M For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
) X6 N6 S, A, E" \! r. V0 H- d& }  i; uDay 12   TIMING 约5 min each day4 M$ p. A: ?* L8 J+ M
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）. ]7 H$ @2 Y( D( Z1 G! g! ^
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
6 v+ F# n" n/ O1 |2 I（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
  ]* Y0 \3 e6 \: E$ w8 J! k（2）        Wash the dishes twice with water.) x9 A5 w5 E6 W. V0 G; R; X( ^3 q
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
& N, f- S/ H  P  I（4）        Wash the dishes with water! m  |" M+ b7 u1 e! I0 P5 g
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
: D" w" T3 d/ F- g; z7 W" a: c. q
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h% ?/ N; @+ M. Y5 T
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞+ f1 d- x1 I# _+ g& F' G. n
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
$ ]  l, [; ~8 r0 D5 j9 K7 \（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层3 L! l! y; ^* P# @
（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）% E3 h# q$ q9 c- B& c( F* a8 }
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
( j# ~  M8 h7 K$ }0 [  O! B（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
6 y) R) ~+ H2 B9 s5 K- o' {（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
( l: V% O7 g. S（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层& `$ P5 A7 _; }- ?
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min6 e, U/ f  K! [4 K0 ~, n% `: h8 }
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml2 m' @* o- o3 e; v
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
/ U  F3 R1 E- |- h! X4 c（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
( X8 h) J" \4 f8 O/ J（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）6 _* @5 m& l/ U* {9 }( r
PAUSE POINT
; d, p: X9 L' q# c. _For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
+ Q! _9 \0 t& t+ Q# Q6 T4 {

sunny2829

什么时候的呀？？
+ k  |" R) }" ^( R0 a# K' C1 {

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子, k  ?4 t. O% c" H0 X$ d* K

1 G& m2 F1 ~4 G这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
3 A, R+ E% a/ ~  T
/ D: b5 c6 j4 J' m呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。9 ?" u  A) \8 R) }, z8 t! n: A" I
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？" R  e7 P; e( l+ ~) B. {
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
5 w/ U+ j! A* C' A这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？( u9 u# B+ U! k* g8 G) w/ C
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
' o  \- A4 f4 A* W6 r8 ]
# S* \5 R3 _5 _呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是- {7 c7 i+ e0 U( C: z
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是! O2 H! k( w3 }
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生  x* ^# J& q5 r6 `( L0 Q* A
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子9 s, Z. `- c; S. w9 p' k

# D- }9 S* C( n5 u$ Q$ `  k太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
+ x$ v/ n3 v5 b& K
% Z2 T5 c8 q0 _# B  m没事，相互帮助嘛