又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

% p6 \* r; ^; R8 G9 f
& V4 P& u7 _$ G& D7 M0 z
在此省略实验试剂和仪器设备步骤$ ]  Z* ?; L9 i7 ^2 H' C
成纤维细胞的制备
0 K/ n& h6 ^- Q2 w8 _1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies7 C, S# d0 n% s1 Q4 b
A 时间：15d; W/ ^, Y/ O3 n6 P1 i, w- t# P
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
- Y( A+ J7 U  p（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
- r" E. ^$ [* {. K9 `& i' d7 I（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
/ v0 M  z- ~( t2 P（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min 4 F% H9 h0 {9 ?. a7 _" R" c
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开7 ^- t! }, J: U% x) E& W
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
' \- Q0 o% |& s8 H2 S（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)4 v( N0 m- g- a9 c
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。" u" _  f  S( U& g' ]5 L. G
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and$ n5 w; k9 I, V& v6 e, {
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
+ Q# }3 J+ _' S! N; R$ w
2 i' w& @& u5 k+ [+ U" ^3 b( i尾尖（B）时间：10d
9 d* Q3 N) ~8 @* J; c5 k在此略
4 }% L; a* ]* g1 X& z3 \8 G! @解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h  c5 H7 l2 g* `
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中6 ^6 c3 ]! Z* |3 c% {" W* C
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
& b# ~, O" U: \0 ~1 J8 U* K（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）6 \8 }5 ]- O& S. |- G2 Q( {7 I
（4）        160g 离心5 min，弃上清/ ~1 J+ L, m2 {. ^, R
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
+ T5 W7 S6 C0 @1 p) n孵育，直到达到80–90%汇合- P  f5 g+ s: k4 _9 T
6 S3 b7 T  @* c7 j
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。6 C  Z$ ?; O# l$ V: Y7 ~4 J
3 t3 [( B5 R4 Q4 h" C
SNL cells的传代 time：0.5h
, s! F0 {' y. R9 K1 o" X! y& N5 j（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
: o7 a. n% l" e- v（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min/ O6 A  f$ k3 @5 T/ N( Q- E
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
0 n. R5 _* K& U1 ]; a) r9 l8 X（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage  i, T* @) ?9 U5 y2 Z  a
4 ~% A, K- {+ i
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h. {! e2 R. p- I  A" k3 Y
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–18 q, i2 i& c; d# w
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。: ?4 a) Q/ I# t. M! O$ z; G+ [
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min) S! q, `) j! H3 \: L" W
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)+ [0 G, j: z  X3 {
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day." f5 @" X& t: M
PAUSE POINT
! B7 k: s) r$ L- u& bThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
9 H8 N5 h' {% _0 ~  r7 T4 j
: L/ @5 Y. I9 F+ [解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）$ i  R5 o& e& K1 {- j
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
3 a! Q( W; Y8 ?8 h（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
$ G& Z9 h) r4 L（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
* {5 ?" N1 V# [" B! `( J（4）        160g 离心5 min，弃上清- [5 m& |% l& i# P8 B
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
& h) [3 p* i) R% S# T9 g（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
  a1 p! t* i- W! W- W- I* g) y* Z; V: x4 M8 ^) j! f$ D9 H) j
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
+ L( f' @1 ]/ ]$ v* B9 h) O（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清  g1 o, @+ s& c" R" P9 q
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
: M) U8 V7 ~/ H  q, Q, [Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h8 d# E" z' y* I! F2 Z
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
/ C( k/ z, H. J$ T3 {; K7 B（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S, m+ ~; v' |( @4 ]! T
（3）        180g离心5min
% j- R3 u) J/ ?' I4 L# e（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮* P  \3 J, B$ `& U7 H7 |$ O
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
2 L" c4 s8 \7 {" f% E9 v（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
& h4 f, r$ q# t/ @) PDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h! `7 ~' ?5 k7 L- u1 }- \& [2 N
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube0 c. ^& y" f1 q9 q) \
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
. V" @3 P+ `+ [6 _% f（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min, t0 Y: c: i3 c9 r
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
) Z8 f% ^' d+ z# `1 a
& a, W% Y! T: w9 p4 j( |- Z关键步骤# \" s: v8 S* d$ ]7 ?
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction3 o. _* y) Z' k, c: b
) T/ t6 G! N! g0 a0 t3 l
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h+ h" Q; o/ U6 V+ H' F2 c7 s
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator. k# a8 C* ?+ f1 V
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h
. ]6 W' T: }/ ^% @7 @2 z$ z, b（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
/ @2 n' b4 v, h（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗2 P0 G7 i) i2 ~9 v! e
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
# {# [0 L5 q2 D( `* ?（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
5 I8 F, P* _" {/ M# ]% ?（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。) O% b- p3 S& O; a2 F! v  G/ {
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h9 P* r8 {& p9 E' V7 {
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。& y6 \- x$ G) s+ J0 u/ o" T
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1* Q  ~- T( ]" t8 _$ U
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.8 B  [6 {) o( E9 H
关键步骤
( g. u0 R# w  I8 J. n* t& r( XRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
6 u# x/ m4 g  _& C
- `7 w# v: h! b$ {# M( O/ h) ^" ]（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜7 T$ h9 Q0 b, F0 N, T8 O+ R" O

6 z& o; k; ~6 `  `: K9 |* L- yDay 5 and 6  TIMING  5 min each day
  C8 w, l# D3 Y24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS3 X' a! }8 d, X7 e" t
Day 7   TIMING  5 min
6 o) Z0 f! z! Y- Q5 K) ]4 b% L( j# Z弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
+ u1 R' }1 e1 K" `9 N# tDay 8–10   TIMING 5 min each day
3 e4 S$ |7 [9 H$ l: H3 w8 H8 v每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
6 g6 a. M% ^! f$ J' y+ qDay 11   TIMING 5 min( m, U& r, B! }! S! @7 O3 u5 q
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
& a+ V$ t. o) }: x7 b' oDay 12   TIMING 约5 min each day
. ^8 v- X& d' G' U# E, J每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）1 A! U- D% i9 |" k
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d" i! ~( n) ^! T( s% N
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
# _# d2 Z7 j. Y% E（2）        Wash the dishes twice with water.
4 R9 t+ f* i9 M（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
. k, }/ H+ g" D7 _/ c* N  h' {" D. \（4）        Wash the dishes with water
+ m7 L9 [: @: Q* n（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.( Q" S8 _/ x8 f' U
( j/ w* Y( n; Z% L$ B
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h% o4 y. f# F1 V. I+ v+ u) W! x
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
! s: T% n9 N4 f, U( o7 k（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min+ ~4 S; D8 ~; t4 ^7 f
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
( D, z! w) k" R6 i（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）# }- Q, P  u( I( U1 v; p6 p$ j" |9 h
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h6 c& }8 l; a( R+ |$ B# V9 [, x- b+ u
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗4 e% x- A: y) w# g
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min$ f. D! I1 ]8 O% i) X' g
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层$ O8 e- e& {* z) g
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
$ \7 I3 Q4 T  R* b) y& l8 j（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml9 x) g" g( _9 C4 H( Y- O$ F2 y
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）/ `  h6 U) ?9 Z9 t0 a2 f
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀9 }5 W& y4 K. I4 i! Y2 _  }
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）, `' {$ v. Q" J. i$ v+ Q; G  K
PAUSE POINT
2 H8 |: p, {" |8 Y/ O+ YFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
- k3 g* G& R' }( o+ S

sunny2829

什么时候的呀？？3 e  V0 q+ d( |7 D8 `

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
) h! m- j. a( Y( v- ~9 x4 o! E- s" f2 {* D! ?: T
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

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! Y  @3 _( y+ }: l
/ U2 S8 q) l2 f/ _呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。8 z; O% f6 q% g" T& A
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
9 Z2 f6 g; |# u新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
6 m" O) w: m/ H1 i  a这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
# z) [2 ?8 [7 n! k" K: t& Z新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

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$ n" C3 [+ ]; F4 P; E9 |+ A5 V( x3 U" y4 f% p5 ^+ B5 q
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
$ z# c) L" _) c- Z# l首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是
( e" K3 ^1 h  {, f然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生0 l! ^- ?6 C# e" H- B8 S7 T
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子4 g' Z2 U( W+ I* {

+ V7 ]( k5 ^- `7 Y太感谢啦！！

huangcong1988

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, A3 {% F1 d$ x' w% c% k! L# C, t0 M! b3 A+ F
没事，相互帮助嘛