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本帖最后由 细胞海洋 于 2014-10-24 09:51 编辑
0 u( ]: ?1 q& \$ `2 D( m+ d2 N* j; [; c7 N9 W1 I& V0 k
在此省略实验试剂和仪器设备步骤. u( X% c5 U2 X2 T" B; b. m
成纤维细胞的制备
2 J3 _+ A V; s- X% a' ?5 E+ R1 u1. 从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies2 @/ o) Y' E3 {, t
A 时间：15d. T3 H3 p9 r; e/ `" x
（1） 通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
( O* d5 p/ U5 H8 b! U1 K/ v# ~（2） 用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除8 i5 ^+ Q3 ]4 k2 k
（3） 将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min * B; d0 v( e9 W- ^! T1 m
（4） 另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min 6 A5 q7 t5 ~' t
（5） 加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
* ~: v0 b' R# R5 @4 k q) h（6） Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
8 v/ A' ?! O) L$ p7 ^（7） 细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1), B- h% G \* o' H+ K0 j
（8） 第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
5 w/ J* Z' F, _$ q（9） 当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
Z: X* `4 \$ f0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
, m7 ~8 N6 u: X% e3 `# k( Y* w% z" ]# D# n" C
尾尖（B）时间：10d6 O4 ` F1 E: Y8 ~8 y
在此略 W4 c, _1 i2 g
解冻 SNL cells TIMING 0.5 h
, ^# e" I! b5 I- ^/ P6 N; T（1） 准备9ml的SNL medium于15ml的tube中3 @/ i+ h5 s' ?' R
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）# W% V3 B4 y0 t* F1 x
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
+ t* N" n2 `2 I U3 j. w; e（4） 160g 离心5 min，弃上清( d A' }, Q9 K8 y/ ]8 `$ F
（5） 用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
/ X6 w- z9 Y+ v/ c9 F' U孵育，直到达到80–90%汇合1 E0 \7 ]6 e# h/ @9 p
: {* N6 _9 y6 U5 pCRITICAL STEP 不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
1 t2 C- `! q. h [7 s4 l8 ]
+ e3 a; {! Z l& M2 E4 u9 FSNL cells的传代 time：0.5h
! L3 A! `4 J8 o3 |（1） 弃培养液，用PBS清洗细胞一次
7 q ~8 l# D. b: ~! n7 Q4 w) m（2） 吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min# {. b5 X# `- a* }% X
（3） 加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞9 }! Y1 |8 K7 n: P
（4） 通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage. x0 \! q, p! ]
% h, y# c5 h) d. ]5 KMitomycin C-inactivation of SNL cells TIMING 3 h, T v# l2 V: P6 V( \
（1） 直接加0.3ml 0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1/ ?2 Z' ]) m, o9 E0 I* b1 g5 o
（2） 孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。$ P7 B+ W3 Y% A
（3） 吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
# d: x* ]4 }- c4 G( W) i（4） 加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)9 {2 _: R6 y& A3 ?
（5） 细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
- v8 a$ H) F8 O7 J6 hPAUSE POINT
! l7 P, @; o& M2 KThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
5 W1 v4 ?# x5 E- {1 h% d0 R4 x2 o2 d" j+ B$ ^" q
解冻 Plat-E cells TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）& Q6 P9 K, \1 P8 W: ^2 J+ m
（1） 准备9ml的FP medium于15ml的tube中( U2 c+ o: B {: r( u
（2） 从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）; [$ j3 z! C( {8 f5 m* K
（3） 用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
H, E- r+ a8 y' W# ^（4） 160g 离心5 min，弃上清7 l* @& l; F6 Q
（5） 用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
) `5 ?9 P+ T2 O- w& y& H5 F+ y; y（6） 第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
! B: d" J# @4 T; j6 T: N8 w, x; ^% S3 I2 n( I
Plat-E cells传代 TIMING 0.5h% C+ _- w0 b. a
（1） 吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
5 @5 Y& ^0 M. b2 o; } L（2） 加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
1 q4 A3 L5 z; E4 BDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation TIMING 1 h' v# N) Q- ], g! W
（1） 用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min: x4 f) ~- J0 P: T2 l1 |
（2） 之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
7 ?" V3 S2 N( z/ f（3） 180g离心5min6 m0 l6 h( h7 S0 r/ U8 i1 C/ s% f
（4） 弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
6 P$ K8 t0 x$ ~( {( E（5） 细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml: d0 Y0 A0 w$ C+ ?0 K% {5 X
（6） Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
4 h8 [1 B, Y! uDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells TIMING 1 h
4 H1 s& m* u J（1） 移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube+ M# j; U! c& a7 M; {+ w! v9 Y* C
（2） 在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min4 T! P8 o* | H) R0 b
（3） 加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
1 X( r8 b' s, e( o# O5 ~/ i0 M（4） 逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜# U$ m3 y- f: _1 M$ F# G
, ?! c. Y- k; m6 Q! J关键步骤1 r) v, F( k1 ~1 g% u
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
" i9 v5 t7 J4 _7 J S+ H, V/ A8 t# w/ R
Day 3: retrovirus production (continued) TIMING 0.5 h0 w1 m" d+ w$ p8 n: a, Z
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator K& B& ~! _, d$ x
Preparation of fibroblasts TIMING 1 h8 w6 d6 U/ K6 E7 \) z4 x+ s5 Y
（1） 培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）" W- h/ u! z4 E% A5 s
（2） 吸出培养基，用10ml的PBS清洗9 @* |* O$ l/ ~$ ~) R
（3） 弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
0 D8 r; ]- J7 C! F) M9 W* d（4） 加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
& @0 A% I) X1 K) x+ O* K1 b（5） 细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。; M1 v6 @( \6 U- q. F) ?# ~+ I
Day 4: retroviral infection TIMING 0.5 h
) M' Y ` C7 y& D" b4 M$ L（1） 用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
% Q, C# U0 t" ~1 b" k. {! C, f（2） 加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–14 Q3 e+ H4 Y, ^# \/ h/ w2 g
（3） Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses." D3 s( Q6 S7 T. N0 V
关键步骤! \. c0 \3 h! R( b5 @5 Q# A1 j
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度' d- w/ D0 b8 k5 l1 m" m5 s8 ^
5 V9 L; v0 K+ D* [' d4 c) Q
（4） 从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜2 R+ v& U( w1 e4 K) d- W3 f
( |2 S" y F: ~, Q
Day 5 and 6 TIMING 5 min each day
" `; O3 d3 S6 \% \% k0 |, H24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS/ D. J$ s3 P- Z( B8 t$ h; K( X
Day 7 TIMING 5 min. z w# x2 t3 N* Y) }
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
: g& ~6 a+ p) _Day 8–10 TIMING 5 min each day! v7 y* C2 D4 e& T7 `6 g* Z3 v% r6 V
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）5 f( a1 P; u7 I; A$ q: U9 J
Day 11 TIMING 5 min9 w# A5 y( u" q7 g" i% V; ^, V h
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1( ^# n2 u1 b, Z
Day 12 TIMING 约5 min each day
4 ~* ?8 W0 o" H$ H) s每天换液，直至colony becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
; c( |: G- s1 m# a3 \5 H7 g3 |Counting the colonies: 结晶紫染色 TIMING 1 d
/ F( x) r! N T, e（1） colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
8 {) v2 ]2 `( G( J9 U; m l（2） Wash the dishes twice with water.
T7 n: B! R4 a* M' C; V（3） 加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
! k3 z. A0 d( V) L; }, w6 d5 l' U! v（4） Wash the dishes with water
5 y2 G3 b9 b7 ?6 b; p, j8 n1 q（5） Photograph the dishes and count the number of colonies." I0 e; y+ A* @. U: s4 A
* r0 q$ p$ J% x( f/ o6 R4 y
Expansion of iPS cells TIMING 1 h
! B8 y4 v* p$ E) X（1） 弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
; D/ A% i5 `& L) S& O. s8 h8 @（2） 彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
- t% a! g. [7 J( G. o r（3） 加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层: N; j: h+ Q7 m
（4） 将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）' v/ h( V/ X% S( F
Preparation of freeze stock TIMING 1 h2 u6 F. b( x8 m
（1） 弃培养基，用2ml PBS清洗
0 h$ N, C! o N3 J（2） 彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min1 k1 n0 x1 `7 s/ x$ i
（3） 加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层1 c' i n) y& J
（4） 将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min9 K! Z* C7 {4 P' ^+ E
（5） 弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
- W, r) U5 U; f* C4 \" z（6） Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）" I5 s T0 \3 q- U/ F' f# {; c
（7） 加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀2 Q% `8 M- U1 X. F" i
（8） Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
2 J6 H1 \" r' U! c3 x7 s* u: ^! FPAUSE POINT
7 I+ W! I/ Z0 b6 R w8 R0 a ZFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.5 z: U0 |& _' G) U; {! n. m* |
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发表于 2011-6-10 09:06
