又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

. u0 y8 L. {2 z8 s, k: X
* K# ~* _0 T' M( Z0 ?5 P9 c
在此省略实验试剂和仪器设备步骤
# \+ l; a+ W7 ]" @0 _" X成纤维细胞的制备
5 Y3 P. Y% [1 s3 ~( ?1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies& ?1 b2 f9 v- Z. F
A 时间：15d
. I  k6 x. T+ _. c- C（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。  @4 n) R6 t8 r$ W5 I( {' r2 C
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
$ k3 B7 r! m1 H! |6 F, I' R: I  s! X（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
( H5 D' d2 @; e& X（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
& @6 o5 P9 _2 |# E  G（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
- p; \) H1 y/ y3 r（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
, [& A- C- [7 L5 \1 C: M（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
1 r; u* v/ j3 A1 s: L（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
, T" w+ e5 Q8 h) m' N8 z: ~（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and9 s- V2 s1 V" p% g: X9 U6 ?
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。& R4 g0 o0 @7 |. y
1 o: {# z. |/ q* z: b" F
尾尖（B）时间：10d* Y( f4 u$ w) j, y4 K# w" J* ?
在此略
& ^  Y4 O. l9 p! ]2 w0 @解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
6 s, O5 h9 N4 k7 K% a7 G5 C" F（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
$ Y, C! u9 e6 n  i* F（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）* a; i" G- }6 c; y3 l
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
3 [/ n; d3 u: X5 Y( P（4）        160g 离心5 min，弃上清
) `$ l6 [8 F- G（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2+ ]' `% W2 J8 `/ X1 X: z
孵育，直到达到80–90%汇合
8 C- g% ^# H) Q& G% ?$ I  N. Z3 e! v$ T9 ]4 ^
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。" x0 l+ v. c6 ^( K( W
0 }! t. ]+ }2 F7 V/ P% G  Y
SNL cells的传代 time：0.5h6 M- I; W* \7 I6 S
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
1 M$ h) V" b# g4 A( k: Z* C/ G（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min# t# A, b+ L; D" a# K, d) U* J, @! i
（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞! @( ?3 B, N3 ]5 r9 i5 F# ]
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage5 k3 h0 E' R/ ~

5 r6 t6 s% w9 |% NMitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
" v! ]% v0 ]4 K6 P2 v& m# z（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1  C5 F7 \- o$ H) _/ \1 O. ^
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。0 G( C3 L' X9 \
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min' z+ g& U9 `1 F* V, h7 Z
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate); }7 n- J# F" u! \8 b7 j& ~2 b
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
  F2 a8 {- z, O, P' f: c. D, QPAUSE POINT
2 l# e2 p# `5 m* D8 J! AThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周1 B& n  T$ P# x# O. w
9 Z* P6 }6 w& O) F8 l- k3 ?2 }
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
( p9 |: b5 G9 ?  g( C2 l（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中. O  P2 A, ?0 Q0 b
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）4 o  K9 I! o, f: Z% c$ ]/ N
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）' Y" ?' x+ S+ n
（4）        160g 离心5 min，弃上清
* @8 a' T& N4 D( a5 ?2 A( q" \（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育# X+ F3 t+ w$ y  k
（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合# ?) k. W: c7 C" c' ]- @

8 z/ }: b' v8 q5 v. b- HPlat-E cells传代  TIMING  0.5h
! ^& R# R% q1 @  ^/ E（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
0 @$ t$ a! x3 n& |5 S+ T, H9 d# i（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合, _4 p+ B# |% n* F1 i
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
7 d7 G: |7 ^; A8 ?# R（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min% L. G+ ]3 `. b& r8 l' t& k
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
  {; ~0 ]3 R. g* l（3）        180g离心5min
/ c/ C' w% u" |! k. Z/ e4 L（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮: |* v) T' H' i  e$ ~# C' s
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml) F3 {+ d* W( t' w( D" z  K& k* M1 l" G9 i
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2' g8 H% M$ D! ~6 h" A$ w
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h" d. J* I! z4 `7 K5 Z- H( l
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube5 C( U" c3 a3 d" j, O. [- t
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
1 |- x; N# F/ I) e% m/ v) N+ r（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
' Q% N2 j7 L! ~（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜" A5 J; j# R3 X, C3 L- q8 H

0 N7 m5 S" V8 x1 a$ y3 e! K  ]% P关键步骤
% s6 f1 n3 e( U- G, v/ A' x2 cAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
) v9 y5 D3 ~9 r
" ]. ?, Y# a6 N/ \4 VDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
4 }! y. _$ c% h# M5 F吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
# j0 l8 v& V( O& nPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h- R2 {$ U7 s5 x8 }' d: A8 z& M5 ^( ]7 r/ c
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）& y4 z7 \& L7 F" G" |1 z
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗& A" t& I: ], J0 F, D* G/ E( O
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
: |, O2 R( P# }. @; s（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
9 A, v! N7 D: c; u" O& n3 _, }+ E（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。+ P+ S( L! H6 A4 m* z
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
3 F, P" ~) J. t  S( x9 p: A（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。8 O5 X4 n" g! e5 G! p7 ~) ]
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
; t8 y: Q) A- g（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
- e$ r# L, i( i* V% b关键步骤) Y$ Z' }5 I. r! ~) i4 d$ Z; x( @
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度: c; @2 [2 d) ~* P; K1 f
  C0 i# w: z5 {% o. d
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
1 T5 }5 F5 l, L* T4 l
; m9 A9 I5 h& I7 r& rDay 5 and 6  TIMING  5 min each day% p6 r( c( t9 ^2 b3 E8 V
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS7 p8 |& O% U$ U; O& ~( @6 ], g
Day 7   TIMING  5 min, s. W3 S6 C9 g
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418( a* y6 a9 I5 ?. n9 e
Day 8–10   TIMING 5 min each day
* U* g& z8 N! `& U1 q7 z/ S每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
, X7 H$ o$ g$ W% |7 |/ qDay 11   TIMING 5 min
) F+ |' M7 `8 l For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–10 q7 }- D1 y4 |$ o6 M# A* D0 t
Day 12   TIMING 约5 min each day
; a: d0 n" R$ i* D$ l# g, p; e每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）. J0 A8 \/ r3 Z& u8 r8 ]% w7 ~
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
7 n# Q& u$ Q6 x（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min4 E/ L. Q1 {3 E: C) w4 k, v
（2）        Wash the dishes twice with water.
* ]! ?0 O2 Y" {# j（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
2 j. O9 j  W) X, ^9 ~0 T（4）        Wash the dishes with water, l& Q- w$ o# G# A, v$ d
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.: }% d' B" D$ x. W/ E

  o8 W3 [" t8 T- ?4 H6 `# CExpansion of iPS cells  TIMING 1 h
% `9 r3 j  F/ ~8 C1 k7 s（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞* ?: v/ H# J  M" R" J  p3 ?
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
- [9 L/ e) B, m: ]% I（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
5 E: s; \: C* d! r4 ~( G2 u3 x（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）$ V# [6 g( k! N3 z* h" |$ l# n7 L
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
5 V/ ?3 J) ^7 Z/ y6 d& {' ]0 ~. A; L（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
0 I' k4 G+ f( _7 }# [& G- Q1 a（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min, G5 J, Y5 B. ?
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层0 m  i2 M% [, Y: {
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
0 {) d$ d% x& d, X2 o（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml% T( l: x, P4 }8 a5 S
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
7 l5 A8 Q, l# ]" q（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
3 ~9 a  I* Z1 B$ e. f  `  L（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）% Q5 l7 }5 T% q" ?
PAUSE POINT/ E& V8 |. Q  b+ l4 |+ Q+ W2 n
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
3 I9 Y9 `- P& i

sunny2829

什么时候的呀？？; s* K% R% F) [$ v9 {; Y1 N

huangcong1988

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4 b  [& u8 p! ^: R/ d
4 ?3 @8 d  x# K这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

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' W' Q# W% X7 j$ i' R7 ?' _
3 ~9 i( c; `4 a呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
, _1 a; B1 R7 _; n0 P3 P这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
. g9 u% R" X! P: [0 b- V新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。$ T+ e: x9 I( V3 e) S
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？/ J, X1 J+ a9 Y1 V7 A
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

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+ j) k0 c" A4 z0 Q
$ ~. z, e* S" x- V- ^呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是% F, R& h. ?* D; u1 A! F
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是
& K9 C( a" e6 H1 \% C: T# R  r然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生1 A2 y+ g. ]- e3 O/ {
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

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( n; P8 B' V* v) e3 a6 x
% \) ^, ]7 B1 F+ G. _4 R太感谢啦！！

huangcong1988

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- {9 N/ I8 m/ J  Y, d$ h- M- R" [& n+ R& ~! s% w- g
没事，相互帮助嘛