又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

, f0 ]1 a6 |2 T2 X/ N9 q
9 v9 d7 c( u4 J" [( V! n$ w
在此省略实验试剂和仪器设备步骤' @7 B) I+ p. D3 c. O
成纤维细胞的制备) _, a, k: P. W! F6 E9 v( {3 q* e
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies* Q: s5 P( d" r3 g' ^
A 时间：15d
* G" b. G* P: N, @! k（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
& w  B% r: z- @+ G3 s% E+ G7 j; A（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
, j8 H6 f" |; X0 ^; u  ^/ @! e（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min 3 h( w3 ?! t1 e" ^# Z' M% e, J
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
0 x4 D# q) t" D# i* t5 |! n（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
4 @( N) W4 N+ P/ a# k! i& h: h（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
- E$ {& Q$ `, j# h2 F（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)5 e: @2 p* x- k4 m1 C
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。* P( h+ N" J8 A; v
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
" Y9 ^0 L4 l0 C" z/ T0 P- Z0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。* ?+ Q4 W: T: w. s

' A9 {: i. T0 K% ~# g尾尖（B）时间：10d
7 _5 L: o! c8 r7 v0 z. I4 ]在此略9 S" u% k  Y& [; G% t* G
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
' y/ L9 x& [) t2 ?（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中0 X$ I" b* e, k- O( @7 N- u3 E7 }
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）0 ]. q: t% G) H/ B9 s' r" C/ k
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
- ^8 C' B9 Y, `1 P（4）        160g 离心5 min，弃上清
1 p/ W. E0 E( D0 x. d  c（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2" U: o, e! a& n: w8 k, q, c
孵育，直到达到80–90%汇合9 s1 N1 `# b8 G- P
8 \$ @& J0 O$ N3 e, n
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
  v# \/ R( n: v: r6 R4 c9 g/ x# ~- H
SNL cells的传代 time：0.5h# E; t$ m; r: M  o
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
; L7 _. s  C+ d" }' j, i* @+ T2 n（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
1 t9 T/ c. _; ^  O（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
% ~7 P8 w! Z. `& y0 D（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage7 {# T. R7 ~/ u6 E4 E9 l" N% d
) m( o2 ?: |* L' g2 \! \
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
; C, {" u( i/ B$ e（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
9 f4 m. b$ P# v* ~' p3 }  Z（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
* G* w  p6 {0 _（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min- U6 ?2 T, }" S& c- P# u9 o
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)
! L- M/ B$ a7 I* L2 {（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.. o5 h) n, C* e0 m. f
PAUSE POINT) l! f- D# z* S7 W9 F
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
" m- p" t$ I  m6 `
9 I* x: k& F; `$ O解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）7 s: n  A1 b, |& u% F$ F$ V
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
+ w1 ^2 }$ C  g" Q! Q6 n% ^1 U5 k（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
& `5 s$ ]# S. r: W5 ^) J1 _（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）. @5 v8 A5 l1 a+ Y
（4）        160g 离心5 min，弃上清
% F1 V+ V) ?/ p) N- M  i# [（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
6 b/ g$ F8 |. S$ F4 F! t, U（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
" [9 A0 a2 V6 u% e" x4 ?4 Z5 Z4 \, y  T6 B8 {
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h6 _+ F4 v$ \+ P9 I% N* t
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清* X+ I) Q, G0 F3 ^6 p
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合6 B, t$ u. ?( P4 C, ~
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
* l" ]$ C8 e1 w, @3 J* [9 B（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min+ K  v$ V& C: X) q! d
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
1 I6 c+ U: M8 G& R1 m7 W/ M  K（3）        180g离心5min
# L% W/ w7 a  k2 e8 r+ ~" H（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮, h* V3 d0 |+ ~5 I( e  r
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
3 {) U" U- B2 q) x9 o（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
2 d# c/ C  }8 k" i1 XDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h- U8 a/ E1 J# K- I* O3 o6 r
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
' w; }  ~7 w+ F（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min1 |4 M' Q: x/ o- g' c0 f
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
- U; _' X4 ~2 y（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
8 W& Y: V, U0 M( V* {3 g- L) E, L: g1 R. ~7 C% F, U2 L
关键步骤! L5 R3 c* B; m1 k) O; m
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction$ }$ v- O4 o& b
' I2 E$ D' Z% P/ F, F
Day 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
* S* \- T" L+ [吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator5 I* m! q7 ?6 Y3 u
Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h7 \& E3 f) Z3 o  A# \5 ?; ?, \
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
8 Y: w* e% D( h（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗" b; K# m4 O" }) E
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
+ F/ {( R5 f& E' Z（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
8 ]/ j# c) w  d) ?& M9 F' ]1 ]（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。5 F/ n) P- K: B
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
' L, ?5 N- s. ]( [, |; v（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。* p5 }/ _) m' ^! J- j2 A1 q
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
4 C( r, N, P9 Q$ {( ]6 i# j- L% ^8 Q& @（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.0 t' ?, H$ q! `  g
关键步骤
7 O, d8 \" b  @0 C2 PRetroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
. I- u3 B0 }& I# I% X, I$ [4 G  T+ _: D( w7 N
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
- e8 d# R1 A5 s- F$ `
) F1 v& O: S; R; iDay 5 and 6  TIMING  5 min each day4 T8 e) Z+ L: Q, }4 d6 o
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
. R: N- D# J( C& h. BDay 7   TIMING  5 min
5 _0 m6 A6 m" Q! o1 L' H5 n弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
9 m0 z. W9 G6 [& IDay 8–10   TIMING 5 min each day
. I3 G/ |- V0 R! l* U& f2 d0 b每天更换培养基（分别在24,48,72h后）: H. U: Q8 H% W7 i
Day 11   TIMING 5 min/ T% U0 v! |) Z. J
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
( M& H. O; h( h$ yDay 12   TIMING 约5 min each day8 U# s# Z  @0 T; ~2 _* E
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
9 u$ A. L3 I7 X+ WCounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
2 }0 L+ i' d6 d2 G2 H（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min7 b+ v) \( r) {  m
（2）        Wash the dishes twice with water.# B' o* u, G) \. J
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min9 H7 J- Q$ A: t7 P0 c
（4）        Wash the dishes with water% a4 d1 i9 f- j( B6 A
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.+ X2 m# j% b; E, w

& K! K! y4 }' N) ]( o0 e/ A/ U: vExpansion of iPS cells  TIMING 1 h! g3 T  m2 y- l8 y! J
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞! L5 O8 V& `; p
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min; Q2 @+ X: j" v( g3 v
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
* Q5 Q' o  Z2 I' S" y% m1 u（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）' ^4 N7 e. s7 T: Z4 w
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
# N; f6 i. q, E/ R6 s/ G/ Z) _（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
% D5 ?/ w9 p1 t- R6 O/ P4 [7 r（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min- y# T# ?% ~% B  G/ X: j  W
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层8 q  Q& b: h6 p" R# p
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
* i' o0 F; h+ T0 R8 m（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
+ n7 ?$ U/ ~2 L2 {% M& h8 O（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）$ q+ D; l, P, t
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀9 Z+ w) }. A; C% Q% |
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
1 l2 I0 G/ u) H$ ]' [& C: i% HPAUSE POINT1 J: D2 n+ t1 h# D' ?, l$ |
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
. ~6 k/ {. `& r$ ]  y

sunny2829

什么时候的呀？？
6 `4 v# n2 ~5 S3 b8 W

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
6 N3 Y! T) k) n
1 j2 b" T( i, n这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子, E1 q# `0 M4 u" V0 v

# q* m2 L: `& Y+ u( [$ |呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。* h4 E5 E3 k+ Q
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
6 S0 b6 S/ }) U0 L+ F新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。. c& w6 N: d& q" ]& g$ f
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
: _( w. X) Q  x% t" C. E; T( S  H! G新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
* D% o6 u  W' |4 S9 W: h$ ^
% w7 p& z4 X: M呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是& Y2 [0 C$ r2 B% |" j* {
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是' A9 T* h; Q% l4 y5 A; r; U
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
3 B$ i" Q( C* R3 V+ W  a1 ^: @3 ^1 w2 a1 b最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子' k6 y! I: ^; g; ^
( J8 l, a) _8 W4 A. g
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
# ~) m" d3 A' C0 i9 c. l* n3 R0 e, t* l+ I" h( Y4 Z
没事，相互帮助嘛