又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

+ W  C9 k" r# U4 G
7 {$ V/ p1 p( a' t, h  R( `
在此省略实验试剂和仪器设备步骤# S* U% J# [! q9 X6 k
成纤维细胞的制备
! Z' I5 \7 E# {1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies3 Q7 X( p2 i0 j9 f
A 时间：15d7 ?7 Q* E8 S$ q( d" j- K
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
! x/ f2 K. g! h& E5 }. F" T, ?- ^（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除$ c! T% G2 t# r
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
( z; S1 x  [8 i（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
) R+ g: ]' W! P! ?1 `（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开8 {& J+ v* ?0 E0 M. j
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。" O  Q/ t. w6 Z+ \6 V
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
, j7 J, M0 g1 m- P( u3 J. ~（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
( p4 j3 M/ d; _" ?, G- D（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
+ w8 O, P: [' Z0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。; ~( `, E  m* h+ _! E# K, X

9 r9 j6 k* j; Y: S& ]& }0 j尾尖（B）时间：10d- M) W8 Y, C8 Q$ N. l# q7 Q
在此略
7 Y, W4 p! e- B' y, ~解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h) Q' G! @, z" H+ t( y" B' A
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
2 D& m" U" ^4 m( X+ k, W（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
; g+ A# L8 b% P7 Q4 Y（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）( P0 f6 R; J% q* p
（4）        160g 离心5 min，弃上清
3 Q6 {' p1 _6 _（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO23 N( j$ R4 ?4 A, l
孵育，直到达到80–90%汇合& I. W2 e$ H- P! n  h9 v7 r/ Z
5 B5 ~  `4 A/ _# t! E+ A
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
, d5 Q% S' h" b1 s# N2 l$ S  y- z- d5 Y: A7 z9 m
SNL cells的传代 time：0.5h
# H! V  E/ D4 i: c2 @（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次- j8 L3 O0 E0 R1 W  v
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
* x0 g: }/ c$ G) E" k（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
+ g' a' A7 g: B* w. o（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
. q: c0 \5 i: T/ P' g1 T" h0 B# u. y) t  h
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
. E5 U$ P( f; z8 f! H8 o（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
& R/ z" J  l- p1 k4 e（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。* @& B  o7 |7 S
（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min/ G& G( [4 D& ?
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate); ~% U0 q/ {9 Y1 G5 i6 J: s
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.: D8 \3 ?  D+ a9 @" c
PAUSE POINT
5 B' p. e% ~& T+ g+ `9 p6 vThe mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
( y# X/ H% o) ~4 B: B2 r3 p5 N7 v- }# l( [/ U
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）: j; a3 ?- P, w4 c0 e7 v2 B
（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中4 h& {% p* Y. l5 ~# P# E) D
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
2 l$ o8 k( R+ N! h（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
$ t( G+ f& ^# x; |: O  }（4）        160g 离心5 min，弃上清' h& y+ k8 r! c, Z1 s" K' p
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
" ]4 r7 ?+ Y+ F# V（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合  u; Y$ C( }3 a5 y: D3 v& a
. \8 D8 F) [' r+ r7 H  t
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h
1 p/ E7 D5 R/ j6 f. R（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
9 w4 v6 C# Q' [$ D7 q（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合9 b! g; r  h* t( r/ |0 }
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h, y3 K1 ]( W, z. t* x
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min4 J/ u5 k( T) N' s% K5 S6 ^3 {
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S
+ z* [2 r% B( G8 H$ e" U（3）        180g离心5min
# z1 |% m" t4 X3 X' C1 Y- S（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮0 C* P4 r4 M/ o4 j# ?
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml0 @* U8 y& U( t3 {
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO29 {, ?: J( x" S8 p% s% q) p' b+ t
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h/ i5 U* Q* p' s* R* Y
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
& z7 O* M4 d& _. u6 z: J（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
' M1 p9 f5 q. p2 s5 N# ~（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min# A1 e9 D1 D$ h2 M" x# V
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
+ f! H+ A) R: B+ }5 s$ o; J: ]2 P. _  \2 C- m1 k
关键步骤
7 W* B. C( k/ f6 pAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction/ C8 c, x+ N; w- M7 w

$ C+ ]2 j$ `  T& U( EDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h9 U+ N6 M- l8 R: A
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
- [5 @* V% a; V$ |+ B& SPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h
/ k2 Q3 M$ E1 a& A$ Y（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
; _, g9 a8 a6 F2 m. Q（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗( O. ]& x( K- ?7 ^
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
2 O, H8 r$ f' \（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中' X( z8 K* v7 G' f
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
' L( Q3 ?! U) I& i: W2 MDay 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h) d8 E/ F; `5 O3 ?. K/ n7 \
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
# E8 }/ Z" k- F$ @（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
$ Y- T& q0 {& ~2 a8 n( l& S% Z（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
3 y& X/ W  ]$ `1 T  R0 v关键步骤; Y! q8 D) h0 m& g7 V
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
0 ?7 U: R* p( d, p% H$ P+ @0 f. e* y
# k* g/ o- \2 o（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜5 c  r4 P4 b7 P" N- x0 D
! k8 e+ h. b7 B/ _; X9 }
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day# r& q" u; Y9 p
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
6 O$ l2 n3 {. l+ oDay 7   TIMING  5 min2 A3 I- Z" B' s; Z8 H
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418! H# B& n+ d2 O: F
Day 8–10   TIMING 5 min each day
# P) d- a/ E+ w每天更换培养基（分别在24,48,72h后）" E# W1 E% M3 c  s* }$ o8 f2 T
Day 11   TIMING 5 min
& u+ M$ G/ O9 _0 S3 T/ T For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
: E0 V7 u1 G- Y$ r, Z0 NDay 12   TIMING 约5 min each day
% \# E& j% X% i: N2 r每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）& K8 r! v- F' |( u% @4 L
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d$ G, ]% h( z3 P3 e& B$ o
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min
+ a, h/ c! }; `- P（2）        Wash the dishes twice with water.6 O* \9 A7 Z* \: X+ q8 `
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
7 l& P3 w( Z/ I1 C（4）        Wash the dishes with water
" c7 U" |; ~! a6 u5 l% J0 u（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.' d8 S  u) \/ ^

- k' M' w; W: U7 a7 j- g, GExpansion of iPS cells  TIMING 1 h1 o) Y9 G* z- B* S0 c/ z+ K
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
1 H+ L: C$ e/ _: f（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
- s+ x1 j) m1 O1 I5 u' d（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
7 l+ m' i7 V7 R2 k（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）) ~! e% s) B7 E
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h9 y" M1 c1 U* O4 n+ M
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
: |% e* W6 r4 Z$ i- Y（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min/ x& {5 m) ?# y+ s/ F5 q
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
: c2 j& O/ I, m（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min! N  f0 l) A( _& M' f2 a/ t8 [& }
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml+ W9 G) v5 j9 r( _
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
& N4 ]& w6 r0 r+ w8 Y2 F（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀7 b5 ?7 q0 h! Z
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）$ Q# b5 k$ Y) C' N' I6 y* o
PAUSE POINT
* G# z* q; s$ a" L+ c; l8 o3 Y' @For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.. d$ [" C5 g7 Z; `& e4 a* _; l8 p

sunny2829

什么时候的呀？？. H6 `; E, T& P

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
$ B' u2 |# e4 N5 \; @
4 b( Q, _4 p3 H$ \这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子
0 J/ v. B# V: H  M( I* ?
. j; H  U5 {  _- s& x呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
3 ~: `9 K& W& p- z; z: T. @; ]) u这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？& v  g! ^# Q8 [8 o
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
' b  T4 N2 Y, k0 L' K* I这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
2 K3 n( k5 R# R6 l% m新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子5 P. F. w- x, V( d
& ~+ }5 o6 r; h9 S# i* ]
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是% L5 _# E6 r. A0 R& z
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是; |+ e5 U3 N- w- l' _* ]6 S9 l
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
* ?; @( J+ [# p2 G最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子, \. m0 s9 m5 X, i3 o2 s- b5 w
* G9 U+ S/ e( W9 f3 [+ v9 S
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
2 u6 ^' U+ y) r* D9 N& F
( `  V; G$ ?. y- j" y- m, S没事，相互帮助嘛