又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

' V8 x$ e6 R, y4 k/ v  N4 m

7 i7 }& A8 w9 w0 P% u' n在此省略实验试剂和仪器设备步骤$ U3 U# d) P$ W7 j$ k# K  m
成纤维细胞的制备. {0 k) C7 v2 N$ M3 i
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies
( ]+ d6 D6 o9 o# u) f( a: A7 xA 时间：15d
; F/ K2 I0 H& U+ e" k& C  l4 p（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。
- V. B( ]7 U. i5 ^- G. b4 a（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除
3 R* ^* G/ K4 q  O0 N7 O0 n' P: k. q（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
& w6 D, j+ m3 @6 T（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min ' q8 x, X4 F- N
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开- B; P2 z. Z) K! O3 ?
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。- X" N  E/ N. a' k4 G0 a$ A
（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)* O7 b2 e0 V( z4 E
（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。
, g7 r5 f- Y9 l; E4 X: Q# m（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and8 ?" g) D# y, f/ V2 p0 t% ]
0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
: f% X! X3 \8 J( h) L/ m+ Q' r( ^8 V, J& W
尾尖（B）时间：10d7 D; n  H" W8 Q5 u& w" `
在此略8 f+ I' h0 [" D6 y: }
解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h
: G8 T; H5 x- q) M（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
5 Z$ N, p& i: I( ~2 ^（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）0 }" }7 }/ n- h
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
$ Y! V- n% K, N# l& \  n（4）        160g 离心5 min，弃上清
  u7 k* R: h2 J% m（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2
# ]+ w) A. z/ a0 z' H孵育，直到达到80–90%汇合
! i" T3 Y* N5 r! a8 I) {5 r) ^* Y. f9 Z# B( F  p
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。) u9 t6 u" u! k2 f/ t( `; b. G

. `9 Y; @! s0 T" V  BSNL cells的传代 time：0.5h
! P  X- p. d, a/ }) ^& z! l) a（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
/ L% o7 R9 r  D7 B; ]（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
1 \& @! }  p  L- s$ V4 G- n, n（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞
! b3 c8 o9 q! q3 l（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
; l8 E! Z  _$ A8 Z* U5 A8 P# ~0 ~+ V1 ?$ C1 E& R
Mitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h) N- e7 s% d1 g4 i5 m
（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
4 l7 ]5 e/ r) A4 i" d（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
4 n! R, ]" u7 t# W（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min$ m3 W! f. D3 S% @" N  v3 m
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)* t- w0 t8 @) }% r8 U9 C- a+ ]; q
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.0 Y2 n4 e! }$ ~' W; F
PAUSE POINT( ?: O8 r" n0 |$ v' P
The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周, n- Y( s- `; Z' Y( `0 d9 i

5 n9 S. A% n+ ?5 q6 E6 {% f  f解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
- \# E5 J1 n0 p（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中
% C, o# F* I: |+ k# P（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
) Z, y+ a& o$ W4 K（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）( H/ }$ Q$ R8 S6 @
（4）        160g 离心5 min，弃上清
7 W. j: F/ o% m+ E) F( l# ?+ i（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
2 {  X, A; s* P* o（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
! r8 j5 M, ]. O1 A$ i& W) q, j, j3 c0 ]7 y7 a$ e* q  N( k: A  c( K! I
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h- ?" c& `, X' w6 U' U  @. f
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清6 D7 G' `3 F" f) s* I5 u
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合6 |' I& ^% @$ j5 C1 X& J4 n4 M1 T0 D1 h
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h  J+ q/ q6 ?+ B4 r0 y- e9 j  n2 D
（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min( b7 b" g) d1 w, H+ E
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S% K8 F2 c1 F+ `' A7 H3 _
（3）        180g离心5min
+ y, ?( h4 M& }- e" ], Z, K（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮3 i  @( o5 X# e) T/ Y
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml
7 [% R# v  k' @& t（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO21 M6 k, j0 J4 \, H; a  `& W' H; _
Day 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h& \6 A+ P8 i' K7 C$ s0 b
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube& \1 O3 d4 g$ a2 @: Y+ a
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min, q7 j4 U; S' B# w" S9 I- R
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
) |( [% W- |8 O$ y1 Q（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
; E0 Z# U7 c* K( X* A! T) ]+ ~+ c5 \' Z; ]$ q
关键步骤
' B3 {, e! w3 n* tAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction9 d- p7 Y( l% @% G# R

5 N' N. z7 C; K0 D9 l6 X+ QDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
9 M, m2 N+ j, {: d- L( c3 f/ j吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
6 I" v" N/ b# _  b2 v5 Z8 \! z" cPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h
: l/ B0 u! u7 m+ \! ~! d（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）+ }3 r' a6 b/ N# a0 O4 ]7 p4 R! `
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗. ]$ ^/ m' h/ ^( d, W) `# H
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
7 D. }( \7 I* R6 F（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
7 b# G0 q) Q' V  S$ M& e（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。+ X& W  d( I2 b! x$ l( j
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
1 o7 g/ H: \& i5 ?2 u. f! l6 Y（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
9 ^' C( M0 v0 R6 o（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1$ a2 X) f9 g3 G) V; L1 O7 j
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.  y, Z( W" O1 d; C
关键步骤) D. _# D% G6 o
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度) a; I. `+ y/ q2 Y* w
6 ^; p! m2 |. C$ j
（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
4 x) {  a. h4 b% R( u9 ]+ f, F
9 l, J. x  |. b2 [, d. F4 mDay 5 and 6  TIMING  5 min each day0 i* \$ C% q  K  d7 |+ i
24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
4 I: ^% j8 F% VDay 7   TIMING  5 min9 B' J; P  a5 o
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418
0 d% [3 K: h% C9 W% [4 hDay 8–10   TIMING 5 min each day
' U; R3 b5 q7 L% u& R每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
$ o7 A7 {+ M: ]. {  N3 LDay 11   TIMING 5 min. u% R4 I, R; \. \
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–11 P  n$ j" ^' C0 H% i" f4 M
Day 12   TIMING 约5 min each day& p1 M; T# F" b3 V
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
/ x9 o; K) L2 ^7 f5 @* \7 oCounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
- r8 M5 U/ |3 M- x( X) \' p, E5 f（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min' N; o7 D% l% r& ]' H" d
（2）        Wash the dishes twice with water.* @5 T( w' S8 m! b) o' b4 V! P! C
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
/ Z' b+ v, O( x! ?（4）        Wash the dishes with water
9 |9 M1 f9 a4 s  E- W: p. I( ]0 M（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
9 E- [9 U  Z+ n  e
6 q7 q, [5 a, {Expansion of iPS cells  TIMING 1 h3 E) y5 ^9 u; w5 T: L" T
（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
$ x8 |& z% b$ m9 s" r0 ]. [8 U* Y（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
1 Z  s1 E4 ^! X9 P6 ~6 q5 l) T! j（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
6 K, d2 G  d, J( m6 r（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
5 E* Y- \+ S! [3 \$ `) |7 P: j4 R% FPreparation of freeze stock   TIMING 1 h
; G' o, L6 k. N) f/ T3 S+ l" A( `（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗
- b' y' t8 F, U4 j/ x8 f（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min: Q6 x0 C4 ~9 u" J* G
（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
! |) }' \# C7 E" B9 a7 v（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min2 l" J( g# j" X, |0 z* i
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml  }* W3 c7 k% y+ Z1 s8 U
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）
8 k- D& }; C5 F: T（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀1 e- P; x  B: v) h
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
' F5 G! H8 H7 c* S3 _; N8 F9 bPAUSE POINT
. k+ v  N8 x$ J# K+ _For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.! U: @/ n! N; S9 U

sunny2829

什么时候的呀？？( n" L9 G+ L( L) k' q; C8 J

huangcong1988

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# {9 ?- z5 ~, X' ^& t这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

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) c; L% `  A4 X) P
) Y. R% F* r% f# u- W9 q+ e/ J8 Z呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
. l  h. u) C" F0 q1 Q这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
: |' D7 [% G  t4 K新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
0 i5 a+ A+ L1 J  I6 b5 v3 J这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？+ r; q" q% f$ `5 J& r& G3 S; H
新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

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6 Y% H, U# Z& A3 q. e  y5 L% K
, l5 m! {/ }1 q# j6 U; ^呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是& Q* ], ?+ x) E: Y7 A9 R$ B( h0 F
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是5 H* u- f) c% y, E2 x7 c. B( q# O
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
, H, ?# E3 {- D最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

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% p9 L6 Z# D5 Q" @2 E0 [- j
  O$ m! k; A8 m! O$ i' \太感谢啦！！

huangcong1988

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) i# a% p! H, h! N% I: _9 m
0 x! Z* O7 x( V! x3 u% U没事，相互帮助嘛