又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

$ f+ U$ b+ M2 {+ i" F8 r6 ]' j1 W1 k; I! Y2 B  W
在此省略实验试剂和仪器设备步骤: ~+ r. ?2 U/ {$ p
成纤维细胞的制备$ l5 b& U# b5 N5 N8 o
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies( E& o4 h7 i3 s+ p
A 时间：15d
7 W7 v& {; N; V( c- g! j0 w' K（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。8 k0 g( C) W8 `  R9 `+ R8 M
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除( G$ I. a( W" a/ p5 m( Y; W
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min # T3 j. N6 C! F6 l. A- ?
（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min   ?: H+ U4 f, Z$ |7 k, r
（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开
+ b" ^3 n  q1 s7 Z" |- l（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
# P% a3 r0 \. s) q- y( o（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
' O. k! E0 a, r5 z- K' |7 @# R! L（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。9 ?$ {  L4 Y" E! [' t
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
  ~: F* d9 h+ L1 z, k0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
+ \" s! H" }- p* {' t9 [. u
7 m0 U$ r3 ?9 B6 ]% R& ]& L# C尾尖（B）时间：10d% |. N9 t# s) p9 b. [
在此略
4 q6 o& {# K' ]3 X解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h) G. \+ d/ |9 p5 y4 S
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中
) @7 `/ _1 i& u6 d7 v% t* m# N（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）9 l1 C. c7 `. P! H9 K
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
0 ~7 x1 D# y. n, r6 x0 z& P8 v& B（4）        160g 离心5 min，弃上清
0 n) X# H2 ]9 n8 z2 Q# E% i（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO22 k: m$ e4 _8 z2 c* n- ^
孵育，直到达到80–90%汇合1 f+ V) u* v( n( T. S0 _
5 W; F0 r) ], R: K* \; w
CRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。4 k' [; t/ h0 k& u  c

5 h* |9 L- _7 }  p. ?SNL cells的传代 time：0.5h! s% a& m1 I8 c; T, b
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次
% X3 o, f  @1 n+ c+ I) N9 G（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
9 f! U, p$ D( W. S/ l& G$ [（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞, u3 X4 U, z" T
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
% f# B# ]( I/ q) k- }& R* S$ p
: O' @5 Z/ }/ ZMitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
  A$ C8 t& s( e7 `- `# o6 w6 Y（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–14 i8 K$ a, f. O, e! L7 P( x" T7 e
（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
4 H* h: I: h* m( ?: F+ c7 K4 i" l（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min& ^/ _3 {* u: g7 W
（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)1 F4 c  b/ r6 N' s( D( O# F
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
4 n* E0 {3 ]) Y' b1 w1 nPAUSE POINT
' ?8 M( n, X1 N5 ^1 i+ H5 ^The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周2 A# X% l3 Z7 W# S) ^  F
! K6 y% Y, N! G, y+ G
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
+ i9 x8 M9 Z0 [（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中9 e, u( A$ P4 c) b8 C2 W1 _/ q
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）
. w; U) q( \: a& W2 u（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
7 Q$ X1 [; V% }（4）        160g 离心5 min，弃上清+ i  {" U% b2 w, G/ x2 P
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
1 T4 D/ I& c; F（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
. J- W; W' P; r5 {& g6 y
0 m5 Y" V& b& rPlat-E cells传代  TIMING  0.5h$ y" m* k1 |+ P
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清" l. k) Q1 Y3 U# r. G0 A
（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合
& _% h$ e) I( U$ S  V( \0 QDay 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
& ?/ ]+ p2 ~; N（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min
6 ?4 r2 @0 u- b! m* y3 O! @5 F（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S- I1 Z5 E) n2 |! ^0 r! }
（3）        180g离心5min2 u4 ^& Z; P. g; b7 O  i% l
（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮5 q% ^4 T- @6 Q" x3 Q( y" G
（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml7 x( h1 C% C) A6 m  ?' C: {
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
- n9 N4 Y6 u7 O/ ^9 m/ o& l' k( ZDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h) ?, t' k  f$ g  Q& f
（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube2 P$ [. d/ P9 X$ N  U9 O
（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min+ ?; y: b7 r( _6 K
（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min; @8 L/ v5 p1 ^, E
（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
1 P; `5 _4 P0 t1 i; O% a% ]! R
5 H) l3 X! a- f5 n+ Z( I关键步骤
% @3 @9 v8 W; j- MAlso transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction0 \; B+ C* h2 F  A, f% Q

& r9 c+ v# A5 X- V: mDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h7 F4 q9 O! O* ^+ y- C
吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
' C' d* @3 F5 d4 @5 }Preparation of fibroblasts  TIMING 1 h
" E4 @$ M( d9 T9 G; f" \# m（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）0 f( _' A9 U* C
（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗
" w0 L, q5 [* `- U（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
5 j) Z; j* g8 Y8 X（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中6 G) U4 }! o2 y" ^' d+ Y# i7 M
（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。
9 D8 G; c) a# A, V; c9 h5 aDay 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h
/ o# E2 b8 i. ^* d, B$ D9 T（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。3 B# t1 j$ x" X
（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–17 x! ]  k0 g) ]+ w2 _7 }
（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.
1 L+ n9 H' @( n+ h& @# X$ Y$ }关键步骤4 ^' P7 l6 m7 w" F* [  R! b! H
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度1 v; ]( O  \% K- R, `* S

( X* w3 h: l9 [$ K" y5 U( }（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜
% V& A0 K3 r. g8 p3 M  x/ J8 _/ U$ e) Z; q
Day 5 and 6  TIMING  5 min each day
! T. ?* t, M) Y" }  s# P24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
, I! G. Q8 O9 ?; d! zDay 7   TIMING  5 min
" o  Q: }- `, `0 `% O, w弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G418' N( N/ {+ j  n5 U; F. E% E% n
Day 8–10   TIMING 5 min each day; U6 d# g% Q# O" l: A3 q
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）1 S" R, S# Z# q4 g  ^4 p) H' Z8 h/ j1 N
Day 11   TIMING 5 min
* ?( y4 N' F! O4 m3 c For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–18 B1 z1 \  P" Z3 b% q+ f; ~
Day 12   TIMING 约5 min each day0 T! g$ m+ N/ E
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）
' Z- d6 t9 T0 t' m- H. Y# ICounting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d
% K6 `; E1 E1 Q1 F/ N（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min: I* S( \5 A, k! y' x: C0 Q, U
（2）        Wash the dishes twice with water.% ^# e+ `7 C: \" k1 [$ V* B' Q
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min9 P) e  ?+ s, \, T/ v, h$ |
（4）        Wash the dishes with water$ m, o. b* h+ b7 i4 [: Y
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
9 g! d$ x6 W# @- d! i1 |. E" n! t7 [( m9 F* _; c2 \# g* p
Expansion of iPS cells  TIMING 1 h
% A5 |' ^" n, H3 U（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞; L- N8 {+ y+ C, K) c5 u
（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min0 M: f. s0 N8 ?+ Z8 ]( g/ ?/ F( Y
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
9 R! y! G4 Q4 l* B（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）
: }: M" i. t! ^6 }- HPreparation of freeze stock   TIMING 1 h' X! h! M& u$ I
（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗: a/ u7 }# a4 @, {- p
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
. e' X. @% t2 s* y+ y（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层, n% N# i7 ]% k1 Q+ U, l
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min
5 m9 G7 y* X% G* A+ t4 ~1 ]（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml
1 w  E$ x: C1 {* \9 |# m（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）9 R+ q9 A# c# T5 f$ Z
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀
% {9 N1 M, P# V8 }2 j2 k8 n2 a6 k6 k' ?（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）
  q4 p5 ~$ |$ N4 j6 nPAUSE POINT# d9 }( u/ a9 P4 u
For long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
0 a5 F3 d% o/ B: y& B* D3 }

sunny2829

什么时候的呀？？6 w( K$ W% i0 t5 T  B# P

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子
2 e7 D( C9 c& C9 W, W4 l* }" m( f1 G) g/ _
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子$ U8 l, o! m6 j3 z( a# l

# a3 o$ E" }: [% Z* y/ t/ Z$ `! m呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
* X- S6 Y% p7 V# _/ K$ L% w这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
+ L3 p: J! t6 V9 j9 N- y! X9 s7 G- \. h新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
8 D' N0 T1 Z; j这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
$ a' O9 Q) r1 g& t$ q新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
8 J! {: a3 p6 |4 `/ H' H5 k' l) k9 M
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是: X# b+ p. U3 d0 e3 S
首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是
. P  I; u- ?5 `8 N然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生2 z) F7 B/ E8 X, e. r
最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子' s. M5 U2 y1 e; [* p1 k, |) ~
9 u9 M; N! I# D! @! k9 K4 r
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子* u% @3 Y: E% V' G

4 Z; o* O& P& ?" \- A没事，相互帮助嘛