WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

zhenhua

回复 7ubo 的帖子0 P& h  L9 }/ h2 G( O4 s5 a; J

8 [. R) U, B" D4 ]& x2 `7 j20ul足够。
0 k1 a' i! l& v* y9 S煮20-30分钟不会使蛋白降解。9 X" q" T! F" t! B9 e
不用离心去沉淀。煮完几乎没有沉淀了。. y9 ~3 `: U$ c7 Y
可以用actin等高丰度蛋白试试效果。, H% v+ a& n9 e$ X: z

lifangamanda

Zhenhua版主，煮样温度，温度？？？谢谢！

wenyangapple

回复 7ubo 的帖子# e& i5 i; v0 n! V- K% ]1 o5 }
9 n' [: ^& _" ~  l! `9 A
右侧是好的结果吧？左侧比较糟糕的data最大的可能性没有裂解开，从上面那些黑色的渣滓量比较的大但是下面条带却很细能看出来。裂解buffer的问题可能是pH不对，或者是SDS or NP-40之类的加的不对。

wenyangapple

回复 hndxws 的帖子
7 v- e2 R4 _2 [, S& h; o; K9 {( m
我觉得你这个是蛋白没有提出来，或者提出来的蛋白降解的比较严重。

pheebs

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25 ( e, ]; o  R2 n) [( Z
呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
/ N: q1 @1 w: ~# z- A* r6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
' m+ a) ~0 A2 m7 c5 N; b+ o ...

, ^: ^& ^! S) Z& ?& \/ T# @
煮这么久，第一次听说。。。

细胞海洋

回复 lifangamanda 的帖子
5 f' @. h% {& l6 R' e0 c
4 v. X" ?; z- d7 u4 z/ T% ^; v点击Zhenhua版回复帖中的回复按钮发言 像我这样 否则他不一定会看到

chb611301

我觉得先检查一下配的胶，是不是SDS和Aps的问提，胶凝的情况。其次是样品处理一般都是煮样15vmin，都没有问题了。我们常规经验脱脂牛奶封闭要2小时会比较好一些。二抗稀释浓度一般都是1:5000，到1:8000都可以的。

7ubo

回复 wenyangapple 的帖子
1 h( _2 P' \" o8 Q  B
+ S, T+ x) E3 M8 p长满的6cm的皿的293T用200ul的SDS loading buffer裂解的，是不是加少了？

7ubo

回复 chb611301 的帖子
! ~  P2 Q( S: ]
  r5 K% l# Q) d( ~9 m% \APS少加点是不是比较好？

lifangamanda

回复 细胞海洋 的帖子
) f7 x4 P" ^+ K3 {; R
8 S1 f0 G& o! Y! w$ V多谢海洋哥！