WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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- E! e7 v# E+ Z: r/ ~+ s  Q# e
$ z6 z$ D$ o8 R2 v  o直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

张也行

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8 @9 L& l+ Y6 w
' a: ^% O7 N3 m我也赞成不是封闭的问题，毕竟其他地方没有杂带或涂抹啊。但是你的蛋白质弥散了，个人感觉是蛋白质样品有问题，（你加够PMSF了吗？裂解超过1h，还要再加）或者你跑胶的时候电压不稳定，或者转膜的时候温度有点高。

hndxws

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+ q! z2 b# T9 D4 C' Q1 w) Q+ P3 y) ~  l" m5 c
我的样品和上次的是同一管样品，只是上次的蛋白内参定量差别有点大，想再做一次跑个漂亮的图，所以我觉得也不是蛋白的问题。不知一抗加多了，会不会这样？

shuixiao

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7 {6 ?3 X8 d; @4 j3 @( U8 m, h
7 s% \( k. O4 ^BCA 定量就行，不麻烦，有专门的定量剂盒，按照说明做就行。6 o, O( p" Y( {2 u0 [: U2 g6 r
我记得你说过怕上样量少了显不出条带来，一般Western可以检测出ng级别，挺灵敏的。如果真的是表达量很低的话，可以采用胶片曝光的方式显色，自己控制曝光时间，低表达量蛋白延长曝光时间，有同学曾经曝光30min，效果挺不错的。你右边那个图片做的还行，如果下面那条带是内惨的话，好像有点不齐，说明上样量不大一致。

7ubo

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! L% z9 s9 S$ P
. ]" s0 B; W& R4 p9 |7 G朋友，你的头像是一种带GFP的膜蛋白吗？GPCR？

张也行

回复 hndxws 的帖子" J0 |! R+ j/ p: [
9 n( I2 E, h& u* I# U1 r* j
一抗加多的话应该整个片子都有涂抹吧，你这个不是只有条带附近的涂抹吗？

Learner

回复 7ubo 的帖子- {+ s5 H7 a, o$ [
* n+ k" G' `- j* [
蛋白会变性但不会降解，预防降解可在细胞匀浆时加入蛋白酶抑制剂并在冰上操作。

hndxws

回复 7ubo 的帖子1 M: _+ N3 \8 K' N5 }3 U0 ?
: R9 b( y3 @) e' @. }
带GFP的小鼠囊胚

lifangamanda

zhenhua 发表于 2011-6-13 21:25
3 P3 e4 ]; w9 X; M* r7 a, b( j呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
' {7 b2 L5 G9 b3 W1 r+ F6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？& F9 u0 L9 P) C  q- p( T7 _
...

2 I" I2 b, ~( K# U1 f$ Y
请问煮样20-30min，温度？

mayansen1314

我看阁下做得好多了，请问最上边的几个条带是内参么？用的是什么内参？哪个公司买的？你上样上的是细胞蛋白还是组织蛋白？