WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

7ubo

2011-6-13 20:20 上传

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如题，6cm的293T用200ul loading buffer裂解的，煮过以后离心是有沉淀的。

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

7ubo

回复 shuixiao 的帖子
. _8 x( H' a* n1 Y( r6 _  [' X0 t) ?% g$ z
用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 aminhair 的帖子2 h6 V6 `5 U8 H) p- E0 t. y
/ I; _+ ~, ], Y9 Z( n9 p# y
谢谢，自己做的

zhenhua

  k2 ~6 ~& Z+ M

' ]( N- n7 F5 P4 T  L0 a- F呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？8 q& N/ d0 l( o/ B2 ~: S6 U, U
6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？
9 x$ J& ^, Y" o$ \+ m如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。  V) Q8 c2 w: b9 i
还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。. W" g+ |) f9 [9 R9 x
这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。0 o& S. i% Z4 q- ]  S
最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

回复 zhenhua 的帖子7 R6 g& s' i: ~+ O

  W' b0 V. L# m/ |每个孔上20ul。7 O* C% M$ ^- X  Y
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

hndxws

7 ~/ w3 y; s2 u9 b+ z' ]) X
; O$ e" C* k+ S+ m' J  _
我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

细胞海洋

回复 hndxws 的帖子) w# ~: t7 C" O3 X

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