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【材料及准备】
% M" C1 X! Y: X6 `! ?3 r' h1.一般的盖玻片，或专用爬片；
& I* H6 x; z( A9 y' v" D2.根据需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；2 o K- V5 ^2 q0 g [ E1 Y4 `
3.将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再置于无水酒清中浸泡6小时，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者玻璃培养皿中烘干后进行高压消毒。
0 o1 j0 ]9 T, \& o. b# e4.高压后取出放入烤箱中烤干，备用。烤干后可放入超净台中。* k- q# Q! s$ I/ B1 C
5.关于多聚赖氨酸，很多人都将玻片用此处理，以使细胞与玻片结合更牢。
$ l' Q5 d9 t& L$ ^5 A6.常用的固定液
4 ^# d/ M. y' Z/ \: [6.1丙酮 可用于一般的免疫组化染色。1 M+ A6 f5 ]6 R, h" z
将纯的丙酮预先放入冰箱-20℃后便为冷丙酮（放心，丙酮在此温度不会为固体的）细胞爬片取出后，PBS洗2遍，便可加入冷丙酮于-20℃（丙酮有很强的挥发性，注意将含有丙酮和爬片的器皿盖严，防止其挥发）固定10分钟。取出后，室温吹干，然后放入-20℃保存。# H$ l3 Q( f% z
: m" V1 k/ r. p3 T6 h4 ]! X2 u6.2 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。 $ A7 r+ ^; M, M0 Y7 e
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，例如各类淋巴细胸分化决定簇(CD)、主要组织相容性抗原等9 L; S7 E& g3 p9 x6 |
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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$ ^2 }5 {4 v3 J* ?; P( ^ l6.3 95％乙醇，可用于免疫组化。, v+ V8 I2 R8 j- K9 @+ @
优点：穿透性强、抗原性保存较好。) G! v* J* H! }* [7 r& g. @9 `" Q( ~
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度- J; b- k- g$ U2 _3 R
室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存
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9 q, b- Y3 x, ^, W0 r6.4 甲醛(福尔马林)应用最广
4 B9 E7 G) U( }3 |6 g* V优点：形态结构保存好，且穿透性强，6 h$ ]+ \) S2 P* N- T" j, d
缺点： 甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色； 分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。' w$ {$ o& d; B
- u$ v/ d2 }2 {4 Y( O【细胞爬片步骤】
) U6 t0 l Q/ t0 Y- ~1.胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。4 |3 p8 A% w* ~, m7 D* e/ Q" M
2.加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。整个过程注意无菌操作。& M$ _$ a: U# m) \2 O8 k
3.根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可
: z1 `- d& o( \& i6 e, F4.待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
! M/ ^& W# [9 N$ ?5.按照实验设计，作用一定时间后取玻片。取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。如果要做诸如24h，48h，72h等这样时间点的实验的话，将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。末取出的可接着继续培养。/ G0 \, V7 X" r7 r
7 Y+ l9 n E& q, `2 w【细胞爬片的固定】! d0 }5 m7 w7 M- ?4 G4 N
细胞爬片取出后，一般用PBS洗2遍，然后再做固定。当然，根据研究目的，PBS洗也不是一定要做的，比如做凋亡的TUNEL染色时就避免洗，因为凋亡的细胞在洗的过程中有可能会脱落。- T& I) H8 `& ^* W
另外在保存细胞爬片的时候，一般用培养皿或板，先在皿底放一层面巾纸，然后再放爬片，这样方便做实验时取片。然后盖上盖子，并在盖子上做标记，为避免混淆，可用透明胶带将盖子和皿连在一起。一般-20℃保存2-3个月的片子做免疫组化是没有问题的。
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发表于 2011-6-23 22:26
