求原因。PCR怎么会多跑出一个条带？有图......

熊猫猫

今天第一次跑PCR，没用内参，只跑了目的基因(217kb)，左边是我跑的结果，为什么会多出一个条带来，而且比目的基因还亮些？
# K/ ?. l# A. R2 V* [% e% v还请给位指点啊......

zhangyan813

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; h3 w' |! }% L4 z7 L$ l4 v* K6 y! g( \$ c; W5 G) k$ `
你们那里有没有DNA和RNA浓度和纯度的仪器，就是紫外分光光度计，提好的RNA可以先上机测一下纯度，要是在2左右就应该很好。要是担心RNA污染DNA的话，可以在提取RNA的过程中加DNase.

yinjiqingqq

应该是非特异性条带，有可能是你设计的引物或是pcr体系不合适，你可以做Touch-down pcr吧，

daviddow

估计是引物设计的原因。可以P出来不同的基因

熊猫猫

回复 zhangyan813 的帖子" W5 U4 N  \0 ?5 k* }) f

. S1 X: o9 S- ~! Q! e您好，谢谢您和大家的帮助
- {% Y, U* N! r( I4 L* F- j这是我第一次跑RT-PCR，所以这张图上五个泳道的浓度是一样的，只是PCR时的退火温度不一样。/ r+ @2 Y& Y, T) R& T* Y! Z; a
以前跑过RT-PCR的师兄也觉得是DNA污染，因为引物比对的特异性还是很好的。今天重新RT和PCR了，退火温度设置得要高一些，还是有杂带，只是没上次得亮和明显了。
8 t, h- x% n4 [' u+ C# o" _2 B下次就按照你的步骤试试哈，但会不会是在提取RNA的时候就被DNA污染了呢？如果这样的话，有没有办法检测RNA中被DNA污染了？

zxcv12345

回复 熊猫猫 的帖子! e/ X4 [  X8 Z  ?- H+ s" Z
9 M7 W+ h; Z. X
1. 不会是引物二聚体，分子量有点大
5 U+ N5 y" @7 w2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

zxcv12345

回复 熊猫猫 的帖子+ Y5 N/ F+ i- u7 G% g  ^

1 Q/ M& y: I% r" B; o; s0 H1. 不会是引物二聚体，分子量有点大
/ ]8 W# M; \3 N" u2 ?$ V% d) g. R2.应该用blast检测一下引物的特异性， 很可能是引物不特异。

langziforever

回复 jun8013 的帖子
# q1 ?% P# ]. I" |+ c& s% O7 ?4 W
5 w( s' o& E) U这绝对不会是引物二聚体！

langziforever

首先楼主的问题就不对，这绝对不是多跑出一条带，而是你PCR扩增的问题，另外，你应该是217bp的长度吧？写错了，呵呵！
) [2 h. b- S' w3 r- Z另外看你8楼地回复，貌似你做的RT-PCR，如果是这样的话，有多条带也比较正常，毕竟mRNA可能存在多种形式的剪切或者不同转录起始位点，3 }- P' b+ \  P3 n. }
建议你优化下引物，或者尝试nest-PCR！

pla269

正常有三条带5s、18s、28s，28s为18s的2倍左右，你的图不好说建议在跑一次