试着提了两次大鼠原代BMSC，均以失败告终，前辈们给些建议吧，万分感谢

taoli10000

提取的是大鼠的BMSC 细胞，腿上的两根骨头都取了，按照别人的一般操作方法进行的，直接用培养基冲洗骨髓，然后两根骨头分装至两个T25的培养瓶，所用的培养基是GIBICO买的低糖的500ml的，然后自己加的血清（10%），双抗（1%），放置三天后，有些是伸展贴壁的非常少，可以数的清，有的是贴壁的细胞都是圆圆的很多，不像是所要的细胞，感觉这些圆的细胞抑制那些伸展开的细胞生长，有些伸展的细胞较多些，呈集落生长，然后堆叠起来，但是总体上数量还是不够多，所有的细胞传代后均是同样的命运：不贴壁啊！传代消化差不多两分钟吧，然后轻敲瓶底，轻轻吹打几次。。。
+ i8 R1 r+ y" w由于条件限制，不能拍照，不知道问题到底出在哪里，在这里请教大家，希望给点建议，打算再尝试提取两次，又担心再次重复这样的问题。。。整个操作过程是看过别人有经验的人之后做的，但是就是养不起来啊！

湖南干细胞

回复 sherolily 的帖子
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国外的培养液也要2周添加新的谷氨酰胺吗？

taoli10000

回复 如冰 的帖子0 U. ]2 F4 }' g$ q: l, u# Z

( g  ]( Z* T7 [2 l9 A* u# c! Y谢谢啊！

taoli10000

回复 qiqishichaoren 的帖子1 p5 u0 {' D7 ?/ F
3 I% h- I; v, u
培养基一般都是4度保存的，只有里面要加的谷胺酰胺之类的是-20度保存

qiqishichaoren

很奇怪的，我们的是GIBICO  的，上面写着保存在4℃

如冰

你好，我培养的是WISTAR大鼠的BMSC，觉得还是比较好养的。想和你分享一点体会：我取的是下肢共四块骨头，每块一瓶，在注意无菌的前提下一定要加快取骨的速度，时间长了细胞的活性会降低。也不知道你用的大鼠是几周的？一般5周左右的各个方面都是比较好的。三天换液的时候细胞量不是很大，但是1周左右可观察到较多的细胞巢，如果细胞局部很密集，可先行原瓶打散，不要急于传代，因为细胞量少的话会影响细胞的生长。您消化的时间可能有点长，消化时要在显微镜下观察，不是一定要消化多少时间，当观察到细胞皱缩快要脱落的时侯就停止就好了，消化时间过长对细胞影响会比较大，甚至会过度消化致死。希望这些体会会对你有所帮助，祝你早日成功！

taoli10000

回复 lizhiyong 的帖子$ i. {& |* P2 s" P- E/ _4 ?* A
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好的，谢谢，尝试一下吧

cheese

回复 taoli10000 的帖子
2 u9 B- |: g, \
$ A  g* V- L# x可以试一下4-6周的，可能会好一些

lizhiyong

回复 taoli10000 的帖子& H" L' a9 q* [( ^
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你是等于全骨髓培养的；为什么不尝试冲出骨髓液之后，过大鼠淋巴细胞分离液，取单个核细胞，用DMEM+10%血清（我用的是Hyclone公司），大约原代需要8天左右可传代，中途可以半量换液，尽量不要天天关注细胞（因晃动，影响贴壁），双抗加的浓度太高，千分之一至千分之三，足矣；多了不宜。传代消化时间不宜过长，0.5%的胰酶+EDTA，约需3-5分钟，镜下有松动，吹打几下，就会掉下来。圆的细胞可能是巨噬细胞等淋巴细胞，3次传代几乎可以排除（其贴壁较牢固）。希望对你有用。。。

细胞海洋

回复 jiojoo 的帖子& n+ ^6 W* }5 b" I% h
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