miRNA引物

kaxdd

我要鉴定miRNA，想问下，miRNA的特异引物怎么设计。对这方面了解很少，希望大家多多指点，谢谢。

runsong

不太容易一下子讲清楚。  \' O2 q2 e4 \* _
我们这里用所研究的miRNA的特异性颈环反转录引物分别反转录出各自miRNA的“cDNA”，同时在“cDNA”中引入通用序列。
/ p9 Y3 \9 h$ M2 O" m再设计miRNA的特异性上游引物，连同下游通用引物做定量PCR.9 R; e; D. F% D6 [6 c1 Q
不清楚的话再与我联系吧。

langziforever

回复 kaxdd 的帖子
9 k' B1 r2 U2 l- ]  R+ F5 l- D5 b9 ~9 `! m' c* p
这个问题不知道怎么回答你，按照你的意思，应该是你已经知道了这个miRNA的序列，而你的目的是要在不同条件下检测miRNA的表达？那如果是这样的话，你要设计引物，应该是想要使用realtime PCR的方法来检测，由于miRNA太小，所以，设计引物的选择很少，所以，也相对比较简单，目前有很多商业的试剂盒可以选用，需要你可以自己去搜索一下。我搜到一个图片应该可以很好解释你引物设计的问题，一般是利用一端颈环结构的引物和另一端序列特异性的引物，使用染料法或者探针法进行检测，但这个是用在qRT-PCR上的，还有一些其他可用的策略到达对miRNA定量和检测的目的，比如northern blot、或者做RT-PCR后克隆测序的方法。9 n& n9 o0 C5 Y6 G. l, Q: G7 p

runsong

可以看看当时我发的帖子
: _; o% K. O, j2 Rhttp://www.stemcell8.cn/thread-35845-1-1.html  Y$ q5 x# Z7 V+ Z1 w5 M5 ]9 f& o
现在我已设计了鼠与牛302a，302b，302c，302d，367，499a，34c的引物。

kaxdd

回复 runsong 的帖子6 `  z9 s- k8 F, w& m1 v. V$ O$ j
! z6 B; Z% g/ v( r1 q% i
我只是想鉴定一下细胞内是否有某一miRNA的表达，不用定量，是不是只做RT-PCR就可以。

runsong

回复 kaxdd 的帖子/ I! O6 K  S4 Z, Q1 D+ n$ D

0 \( m- ?- G. L! t可以，但要摸索循环数，我感觉同一miRNA在各个样品中的表达并没有质的区别，只有量的差别。

wolf1978

runsong 发表于 2011-7-11 23:00
' R! d* }( E+ W5 q( N2 l9 D回复 kaxdd 的帖子' H3 \0 D  y# C. I5 q- D" {
+ s% R8 X3 v' ~6 x# d
可以，但要摸索循环数，我感觉同一miRNA在各个样品中的表达并没有质的区别，只有量的差 ...

* l' z7 H6 ^& t5 a) _' {
同意，以RT-PCR的敏感性，含量很低都能够扩增出来的。因此对自己关心的体系最好有个参照，以达到相对定量判断的目的！