MEF是先铺后灭活好还是先灭活后铺好？

dilal

MEF作为饲养层是先铺板待长到一定密度再用丝裂霉素灭活好？还是先用丝裂霉素灭活后一定密度铺板好？
# ~" q  F* D; l+ Z8 X( }" r个人认为，两者都有利弊。前者对于细胞状态的可控性比较好，可以选择细胞状态好的细胞进行灭活，但是不易控制MEF的铺板密度；后者灭活后消化铺板，细胞状态可能会出现波动（消化过程中的各种因素），但对于MEF的铺板密度易于控制。
, d. V0 d5 F! r& Z) H8 i不知道各位采用的是那种方法，欢迎大家讨论各自的利弊！

lindan666666

我们也是先丝裂霉素处理一大批，计数冻存，然后用的时候提前一天复苏就可以，死细胞很少，接种的ES细胞状体很好哦

bigsnow55

christophe 发表于 2011-7-22 13:21
& P0 n4 S* @; j回复 dilal 的帖子% T8 r. S9 ]! f  F3 d5 V0 ?
) M: D9 F3 B1 Y" u" n* O. `& Y4 H- g2 ]4 ^
我是用的后一种方法，每次处理一大批，计数冻存，然后用的时候提前一天复苏就可以，感觉 ...

/ e5 M# S1 e; S  R6 q3 Y  ]学习到了很多，我以前都是现用现处理，然后传一代，感觉很辛苦。
) f0 i: v  `$ a6 ~' w' ?3 ]请问你们每管冻存MEF的数量是多少，种于多大的培养皿，冻存液的体积大概是多少，谢谢！1 i3 N) i' b' ~6 O" d9 I* E# K7 F
因为我想，如果是60mm培养皿，需要MEF细胞42X10000个，是否每管就冻这么多个细胞，还是考虑到复苏时有些细胞会死亡，冻存数量稍微多一点？

cortex

大多数人会采用，处理一批，冻存，用时解冻，这样相对比较方便。当然先用现处理，状态要好一些。不过，如果细胞冻存处理的好，影响倒不是太大。至于楼主的问题，你确实不好保证你要的饲养层浓度。再者，这样可要好好洗洗细胞啊！

houbara

either way, it depends on your experince. If your feeder cells is established cell line, such as STO, frozen mitomycin C inactivated cells is more convinient. and assure the repeatbility of your result.
0 B( ^3 M2 y4 N2 z( f! Q/ L* [But it always better to do a couple  of times trials, and work out your working protocols.

准姿梅影

我一般用P5的MEF，现处理，工作量是比较大，但是可以通过解冻细胞的状态判断饲养层的好坏。大批量处理再冻的方法也可以，不过要考虑处理后细胞在解冻后是不是利于ES细胞的生长，各有利弊吧

bobo198666

一般是P2代处理，长到80%左右用10ug/ml丝裂霉素处理3个小时，冻之前一定要用PBS洗干净，4遍，否则残余的丝裂霉素对之后实验影响很大

dilal

回复 varing 的帖子
8 R5 Z+ y- }6 b& h3 b8 L+ V* s, s$ P- i  Q% J- ]7 g
分析很到位，的确是

varing

两种都有优缺点：# e8 @& o; Q* O8 _" o1 O3 W7 \6 Y3 K
丝裂霉素处理后冻存，复苏后细胞一般会死很多，没有不处理直接冻存的复苏效率高，优点是取出后复苏好就可以铺板用；
" ^1 o  U4 o: {& \( P% `先冻存再处理的话，复苏效率高，但每次都要用撕裂霉素处理一次，而且复苏后一般会有一代左右的传代操作，等于细胞传代数又多了。
( K; i- y- @. m7 T本人倾向于第二种方法。虽然传代数多点但细胞数目密度能保证。

majing217

先处理，然后冻存，用时在复苏。