基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。7 l0 S7 B- y& L# I
' p- Q" h1 u# f8 f0 A: t
注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。: t% h% a5 @+ \* |- \# j* t# c
       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

: b( W2 E! k: |( t. o9 t& _  to runsong兄:
/ r/ q! [/ }8 I- L" z# X$ D2 h6 }$ ?' v, |$ L6 G, t
  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.
/ u7 p3 s" H  R0 c% c( P" J+ M: M/ S# y0 Z! v2 Z4 M( Z
  具体的方法我就不给你啰嗦了.7 u" y3 }% |( `& i, g# T, @
  }% q7 C! d* j3 G4 ]
  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.) o( K: ]' _# W/ i' C8 C4 V

6 _2 H& W, L0 n  而且以你的经验做起来不存在任何问题.7 U0 K0 L% O2 ^- f8 j

% d3 o+ _/ u# I4 X% u( R4 `  你先做做看, 有什么问题继续交流.4 Q. L) D+ [8 L, m" `( e9 Z% k7 a* I

  H' i; i. ]' U. S+ N  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

& f) s3 v9 S1 |& n' ^( a* r9 v5 T

/ _$ ?! F, d- G1 @: nNature protocol 全文:. C+ b4 G8 ]" l' N' [- Q

1 J1 Q* t6 g1 g5 sMicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells( S( H: q5 K5 ~: p2 v8 O
: L6 E2 f+ K  V5 w; F

runsong

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" i7 c. p* |7 f
4 D7 q% X" ~# T8 x谢谢大师兄

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子: y+ V; I6 B* @; I; m

! s3 ]6 Z& ]3 M: @那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。0 W4 e; f3 f  G; a
不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子0 \7 W$ Y3 j$ Q9 v( x
- {% F. H  v( y* C
/ z8 R$ B: D8 N7 j' _
   to runsong兄:
* q- P+ M" r8 ^4 S* `# U
1 V: g' b) @+ ]   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.0 ^3 k( p. P; N8 ~

/ u9 e! S  O  B. }# ]0 n6 [6 k   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.8 _! q) s* I( v! _7 K( U1 k4 _( K

, x( U0 Z$ R7 u6 G9 q# X; x( x   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.6 d* |7 q( \8 }: C, l
( F3 B- }7 ]2 |9 l( k' `! E

runsong

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1 j+ n/ e5 |3 Z$ u
0 s2 ?4 _' n% N; P& I, _不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。" P2 I5 k' n3 F8 o
其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

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5 ]* Z" @" w; G) i' t2 K# {: Q9 L
7 a: S, U/ Y0 _, o& r* \% ?0 c: p. u% i% _' \2 C- }2 `' B! p3 L
         to runsong兄:
& x, j% T0 |0 r; b+ _; \$ k& f5 N4 j3 U5 N
  1.  回答你5楼前半部分的问题:% ?0 \  F: l- @" B
4 g$ P/ L' h. a- f( {
       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.0 m5 T& {7 Z: m( P: b* Y* Q# @

7 f! I, N" f" M. R0 ]       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.$ J1 g! z9 N  O9 @/ i/ O! Y
       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.3 Y+ o7 M3 M- V+ p' [+ R( I6 F9 d' y
" a/ t/ `( O) ^# N  R
   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.
5 A6 [' P: ?5 ~# f) u4 K! W: C7 ], a# C/ w9 O9 ~  `
       所以你先考虑做7次的重复吧.
0 B6 _# ^% S9 I; I1 a- f' M8 t
; l2 S3 A0 U1 ?% ~. u       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.
" n- H, R  i) O- Q  R) A& r9 t+ G9 w9 {, v, L* E

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。