基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。
- d9 C" a9 J- m3 w
1 r6 U( W" @8 \: n3 F1 }% a4 h注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。
  L- V, A  Z5 k0 _  \. |( Y       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

9 h# Q6 z; }6 x& Q7 s9 A$ l- g
  to runsong兄:
" n& Y) G2 g& v6 k4 C& N7 z- A0 u  j7 o7 J! Q
  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.
8 w, q0 t& \) m9 \( |# A; M, O: k! H$ V. K9 I1 C, x" q1 Y
  具体的方法我就不给你啰嗦了.* Z( S* k+ L1 q

/ L4 E9 i* R5 V& o9 J  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.; b0 F) m; y* }3 x$ V

4 E% n- N/ }. R& v- Z5 e! W  r  而且以你的经验做起来不存在任何问题.
; y( y0 Z3 |4 M
# S/ I' R- _" y- n  你先做做看, 有什么问题继续交流.* X0 Q6 E6 ^& Y( C8 L& V
7 G5 [, T2 R- z2 D
  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

7 Y" h- X$ ~9 J# h( {: J3 X0 V# q1 ~- G. P4 l! m
Nature protocol 全文:2 M$ ?, ^( N) Y+ s, L

! B) W* v- H7 XMicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells, f6 O0 f% P2 ]; Q  Z

1 D) O+ _; T- T9 o

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子0 r, S1 N+ O# P; A

( q( u6 y8 F8 v8 w谢谢大师兄

runsong

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7 `/ z- C! B/ I, Q; b. f( d( N! @& A. ~
那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。
# ^* G! z/ p& {7 k6 G! o) {* ]不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

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+ Z1 _" ]" O. W3 T, N1 |+ C( Y+ U1 Z( W  w1 F' V& t) [9 M. N2 `" z% l  I

6 @  q# ^/ a: |) j7 ?   to runsong兄:8 I& ?3 k5 J0 |+ Z
, V5 \3 d2 L$ g! R
   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.
3 _3 n/ N2 Z- G$ J: m' |7 w) k
% D% [; t5 @0 j( ]1 }* M   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.5 s/ e% E0 Y+ e
) R9 K( Q/ g5 m8 G" N+ T7 B$ w
   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.2 N3 g4 ]0 p! U4 z( C5 N6 p

! n% C3 p3 e& U  _" V& M

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子6 }9 @# o* E5 o' M! E: S- ?

" `, O. E9 Z- [* W' L& ?# I不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。. P) f( E8 H( C
其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子; u2 _% W/ `+ T& H
) F8 E  S! S1 `; n6 |" H7 s2 L

  [! [& l# w5 U) ^% |) d' _+ J         to runsong兄:; G, b( W1 T0 J( F

1 n/ A0 j) y/ P, z8 @  1.  回答你5楼前半部分的问题:- [7 t1 G, [  H8 L

4 j6 t% C1 B  K% ~+ h6 W: A       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.
% {3 ~1 e5 D4 ^$ E" R, F. E- Y
       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.. {0 J6 T0 T/ b) H5 G
       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.8 h6 S7 M! x; Y. b" ^

1 U" T6 `) p' G   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.6 b4 v' X/ a* q+ c/ z% a% ~& @

2 u# R. Q8 J/ o! p% S4 C       所以你先考虑做7次的重复吧.
: p$ _' E' P, l( @% [% {; H# H- g6 U* V( y' _
       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.- d. y1 W8 V. b5 o* I3 {1 B- n3 y) P
) P+ r% L3 `' w( y2 l5 ?% S

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。