基于载体的miRNA抑制剂表达克隆方案

runsong

本人想通过慢病毒表达miRNA抑制剂，不知各位高手有何良策，不胜感激。5 Q& ^( a& t' Y1 x" M" e
# a/ j9 t8 V2 }8 R5 Q! H
注：一些公司如复能基因推出过一些产品。但我问过，一个载体两千多元，老板是不会同意的。所以我想自己构建，基本构想是基于PLL3.7，模仿miArrest™（http://www.fulengen.com/product/mirna/inhibitor/），但其中的细节我查不到资料，如果有人能给以指点，万分感激。
1 |% j' p+ C4 S$ n" q  q% V       本人经过一年的打拼，在慢病毒包装，小RNA方面积累了一点实验材料与经验，希望与各位战友共享。

深海寂寞鱼

" {8 R3 z% {% G: P: l
  to runsong兄:
4 A2 D& s! p- v0 B  I. W; x: }2 f" i7 c- T* _3 K
  建议你用miRNA sponge, 简单, 好用.' w& ]2 Q( d( _, N3 n6 t. `

4 D' n+ ~7 ?+ a3 F5 ]  具体的方法我就不给你啰嗦了." q2 l4 E* a% m. |0 O5 l- c

# U- H9 @/ I+ V  直接把nature protocol给你. 里面写的非常详细.
  |4 l1 X  `1 e, J8 p$ n- c  c0 {; U2 v8 T. j; l
  而且以你的经验做起来不存在任何问题.2 f5 c9 `( J8 w9 W1 w; w

) M8 l7 v2 R8 C6 U8 b  你先做做看, 有什么问题继续交流.. {+ I; f, v& Y4 d
- |. i9 r: d0 I  m- A% T
  看来你的实验是一步一个脚印啊.

深海寂寞鱼

/ t' B3 Y5 u1 D" z2 P4 R: B) W5 x
4 U/ K, x, F. _; o$ [& l
Nature protocol 全文:3 ~$ t3 l; a' a4 E
) ?, e0 e, V6 c! |, y2 ]
MicroRNA sponges: competitive inhibitors of small RNAs in mammalian cells" j- o& i3 L# H( ~6 b5 J

3 u- {  a) f1 ]& Y* L

runsong

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6 h$ a. W4 D; W2 l
6 `) R" ]3 r2 @: l谢谢大师兄

runsong

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$ Y" v) X( Q# v9 }/ Q
$ S3 r; Q! H! O& s+ R5 x& y3 d, g那我就把海绵加在pll3.7的U6后面。$ g# r+ g+ V6 ~+ U, C, z% r: t
不过还想请教一下，如何经济高效地实现海绵单元的重复？

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子! b4 a5 u- [* r# Q" G9 O3 x6 {8 m, B
5 C% n3 i  _; p4 M
% U- [8 H( R$ {; g  B7 K3 x0 s' ^
   to runsong兄:% c2 g  N- @2 t; {
5 q; w5 n- g4 a' |
   你问问题总是会问在最最关键的地方啊.. G& t# X' ^2 D! S7 G$ g: ?. n1 Y
% D1 Q  x: p; s3 C
   想高效,就花钱,直接做基因合成,方便高效.省时省力.
0 J( v7 Q, {, f7 J, K% p; j" ~8 C  N; e& X
   如果想经济, 就用多片段合成,然后退火连接. 稍微便宜点.  但是加上时间/人力和其他试剂,也不会太便宜.
( @8 w- C# f' ?  u2 I$ Y) ~4 m' V  u1 \  l

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子5 f( e+ A, F/ q. U+ R2 d: i7 y

0 l' s  w; |$ C不好意思，再打扰一下。你们的海绵单元一般重复几次啊。( w7 s9 {" R* U2 |5 i" t
其实我以前一直想做海绵，就是卡在经济高效地实现海绵单元的重复这里。

sannia

这种方法还没有经验 过来学习一下

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子& k# N- Y) F1 H' v

' ]( b! P- c% a5 [+ e1 o: V0 u/ ~$ F
         to runsong兄:$ n% r, I. `" q# ~+ \! a
2 F8 n% v) I! r: S3 D0 ]2 T; H- V
  1.  回答你5楼前半部分的问题:9 k! Z9 n* K  ?  x* u
7 ~6 [1 q7 y. u! z: r2 ?/ m
       把sponge插入到U6启动子或者EGFP的后面都是可以的.1 q8 |$ N  K# O! E

% b+ j7 S3 ?; Y% k1 D       我上传的文章中也有提到.关键看你后面的目的.
8 x% g0 @8 Z& ?       如果放在U6的后面, 你为了终止转录还需要加上一串T . 势必会增加合成的长度.$ B2 x7 I3 s+ p9 k$ E* b
. j8 P9 z. e$ {- U
   2. 至于sponge重复几次, 这篇文章中是重复7次.
6 p/ X' H% ~9 ]
# J2 m& C' X/ j4 _5 E, E7 k8 g; t       所以你先考虑做7次的重复吧.
. Z- o7 ~; A8 F9 g, T3 G( a! F) N$ Z7 U
       至于少重复几次到底会产生多大的影响, 我还没有这方面的经验.% z5 ?+ x  R/ r) ~* D
! h: @% z- r& p) x- t5 s

snokey

实验室有人用合成的siRNA 来target目标miRNA的loop部分（听他说一定要cover到pre-miR中有空泡的那个部分），大概能knockdown 70%以上的活性。他没有做成病毒载体，如果把他用的miRNA序列做成病毒载体，应该效果比siRNA效果好吧。