ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

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4 q: `& o% `2 D7 k
$ d: z: q- \4 ]5 R6 i我冻存时是采用裹很多脱脂棉，然后放在泡沫盒中，直接冻到-80，好像两天吧，然后转到液氮，但是前段时间实验室液氮出现过一次液氮特别少的情况，不知道是不是有影响；复苏时我将水浴锅开到38度，立即化，取15ml离心管加5ml培养基+冻存的细胞，800转5min，重复两次，然后重悬细胞接种到饲养层上!麻烦指点下。。。

jefferson

ES和iPS的复苏效率是非常低的, 楼上也有人说了, 大概0.1%已经不错了.  对于冻存液, 我们用的配比和你的一样, 但是在冻存复苏过程中有几个问题需要特别注意: + [4 ^, P# S: Q+ _% w+ s/ T
, w4 j8 m8 ^% O0 Q) L7 r
1. 冻存后先放至-80度冰箱过夜, 第二天转液氮,不能在-80度中放置过久, 否则复苏效率会更低.
8 F8 ]" c* S* q/ f6 e' R4 H2. 复苏时,从液氮中拿出后马上放到水浴中解冻, 待融化至一小团冰块时即可, 马上转到无菌环境中开始操作
2 R0 w" t9 h( F: w( y3. 先将细胞悬液加至离心管内, 然后慢慢滴加ES培养基, 边加边晃动, 使其中的DMSO浓度逐渐降低, 减小DMSO浓度迅速降低对细胞的刺激.
& x0 F& g( w! ]' Q" @' I4. 离心时最大离心力为200g, 因为不同大小的离心机在相同转速下的离心力是不同的. 所以需要用离心力来标定.
3 s1 f1 N, T- e8 ~/ w5. 离心后接种到MEF上时, 如果有条件, 可以添加Y-27632, 一种ROCK激酶的抑制物, 可以很显著的提高ES/iPS的复苏活率.

oucflora

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6 U+ n  E7 A/ V+ J; v( X, _1 A1 A  }- y. D, j  D% U
在冻存细胞时，DMSO浓度太低，会导致细胞在冻存和复苏的时候细胞内容易形成较多的冰晶，造成细胞成活率较低。

Yedan

回复 rongrong 的帖子& C+ _- L$ F# E+ C2 Q, U, ]! D
; E: Y# R. z& E
800rpm 这个转速是不是微低了啊，您确定细胞都离下来了？/ q3 \' N% k, e/ d1 C. t' `1 w
我们实验室从来都是1200rpm的。。。" U: F7 @5 |% M; k

1 A  d; ]1 ?7 O4 y$ ~0 O补充内容 (2011-9-4 17:27):
1 ]! g  R3 y, a3 d另外，不知道你养的是人的还是小鼠的，如果是人的ips，复苏之后死很多很正常，我们实验室的博士后说她在美国养的时候，经常是0.1%的存活率。

Yedan

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8 ]( [% M8 R. Y/ I1 V+ r8 \: \; G  n: N
' Y' t% y- H6 T10%的DMSO难道不对吗，您说低了，求解释……0 `& `6 e1 i# T) A0 A

evial

细胞死了是经常有的是事，再做一次，照英文版的做

oucflora

冻存时DMSO浓度过低；
! x* {3 ^. E8 o/ T! S% F4 N另外不知道你冻存和复苏的操作程序是怎样的？最好详细说明，好让大家看看问题出在什么地方？