ips全军覆没，我该怎么办？

rongrong

大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺好饲养层，将融化的IPS用全培养基洗了两遍，每次离心800转，5分钟，然后用新鲜培养基重新悬浮细胞种到T25的瓶子里，但是第二天发现好多好多都漂了，没飘的居然都是单个细胞，我都快被它整的窒息了，大家看看我哪里出问题啦？这是为什么呢？现在就是叫天天不应叫地地不灵啊，老板明天有要批评了，唉！干细胞太折磨人了

yangel

rongrong 发表于 2011-9-4 11:45 % G( q. x/ N: u8 l4 t5 h
大家好，我是一个IPS的培养新手，我4月份冻存了一支ips，冻存液干细胞的全培养基+FBS+DMSO=6:3:1，复苏时铺 ...

' b# i- |9 G' L8 [+ B
做的没错！复苏成这个现象也正常，再养几天看看有没有小的ips clusters长出来。要提高复苏效果的话用Y-27632处理24h。

hnczlw48005

复苏温度应该在37°，冻存干细胞时的血清很重要，最好用进口血清，浓度越高越好，可以用90%FBS+10%DMSO作为冻存液。

jiefengbing

回复 cicadacjk 的帖子) L, y3 m/ e! i9 \( H" A2 v
& e0 G7 ~% U( o& [! g
wicell 复苏ES不需要离心？正好我手头上有一份，200g离心5min,然后gently re-suspend cell pellet.不知道您的步骤是哪个版本，可否让我看看？

rongrong

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* u# E3 W  {* P* i( Z$ [/ t1 i( T- u
恩，好的，谢谢鼓励啊，继续前行再接再厉

evial

FBS：DMSO=9:1你的浓度低了

oucflora

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# ?- F$ n; C8 G0 m/ X  l- i2 H  }8 V* G# Y3 J
在-80度放置两天对细胞成活率影响不大，倒是液氮量特别少，会导致细胞死亡较多。
& j. a" r6 A8 n% ^* X7 j$ `8 C  W/ u. R6 p0 Q; C* R
补充内容 (2011-9-5 20:27):
6 A  }9 {- z# q. @" [; ]7 u不过如果你们的液氮罐是保温较好的进口的话，影响倒是不大, h3 {9 ?" g1 t" `3 C
7 J) l) j% y- M* L. e7 R
补充内容 (2011-9-5 20:28):7 N2 o/ U0 A' v$ S* O/ f% _2 i& C" Z" W
“进口”的意思是“非国产”

oucflora

回复 rongrong 的帖子' ]% Q6 H# W2 A0 Q! [
, `9 E3 f% @* t+ @+ F! h
20%,曾经一个师兄用过更高的浓度，大概30%，细胞情况也挺好。

cicadacjk

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# S; `. y' L& [1 U* G8 o! O% W( K% o( ?
这位同志，你对DMSO那位版友反问来反问去也就算了，明显DMSO就是用10%的/ F5 Q- |* P0 B. V* T4 x
对jefferson就没必要这样了吧
/ l( m# V& q6 n+ eY27632是ROCK抑制剂，可以使人胚胎干细胞可以单细胞传代，能够把0.1%的复苏存活率提高到10%，我自己观察没这么多，但效果还是非常明显的。2 h) d: H4 s$ g( s: v! f+ z
至于Qilong Ying的2i是指MEK抑制剂pd0325901和GSK3抑制剂Chir99021，是完全不一样的东西。* U$ f6 S1 f2 d# H

) [4 l' b: f7 o$ U! t; X按照WiCell的复苏方式，根本不需要离心，他们认为残留的DMSO对细胞的危害，还没有吹打和离心的危害大。如果的确需要离心，一次也就够了，晃一晃就可以了，除了吹起沉淀那下不要吹打。

张也行

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+ q3 E& M% ]- J做实验本来就是这样的嘛，没必要这么灰心。先不要扔掉，再等一两天，如果没有污染，说不定还是会长出来呢。