MSC 冻存问题

yuwenlan

冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。
3 ^0 T8 y9 G- K0 X1 f娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。
; j1 U3 P9 z! i% y2 ^; A6 l4 ]注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。8 B, p1 g& b% [% I
Good luck.

tkpss18

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。
4 G7 K) \& B8 H+ o# A冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。
! I: d5 t/ A; p1 |复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

飞翔的十字架

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% ?, [% k( p7 Z' u# ]" [# y
" n# |  h3 o) M+ X+ s- Q程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

deshenglll

复苏时间要少于2min。

deshenglll

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

dwl1209

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% C9 A8 K0 i' e& v3 ]) Z8 J8 [
- d( K! O7 L" E1 I! t请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

wangyimei

) p* `1 T: \7 @( w4 {) y9 r: [1 K9 f" G1 V& K" I: z
按照文献上说的都是细胞在复苏的时候，不需要等到培养液全部都融化，而是大部分细胞融化，有一些小冰晶的时候就可以了，然后吸出细胞到离心管的培养液中，然后离心，种到培养瓶中就可以了；第二天再换新鲜的培养液，以去除冻存液中残存的DMSO；1 ^8 f; _/ s! ~, E( @: ~
还有间充质干细胞在冻存的时候不用走4°，-20°的温度梯度，直接将冻存管中的细胞就棉花包好，直接放入-80°冰箱过夜，第二天放液氮中就可以了，复苏效率很高，至于冻存液中各种成分的比例可以用FBS:DMSO=9:1;也可以培养液：FBS:DMSO=5:4:1来冻存。

andylee824

  在水浴锅中,快速的晃动，是等全部融化了拿出来，还是有少量冰晶拿出来？9 p7 |1 g( M# Q8 J+ o
  楼主的意思就是等冻存管中全部变成液体了，再拿出，是吧？

hwlightning

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) _' ^$ T" R& ?- G& I& f# m* A: |: l6 z" B, L0 N8 a
要慢冻速溶

andylee824

回复 hwlightning 的帖子, ?) d( R0 G) l+ j
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你说得复苏时，不能有冰晶，意思是在水浴锅中，细胞要完全快速融化吗？