瞬转后用puro/nero杀哪个好点

hyde

电转后细胞用puro杀总是养不活^^* `" [, p8 ?2 G1 P$ p9 M5 i2 \
考虑过用nero,但时间太长质粒还能起作用吗?

懵懂干细胞

puromycin ? 你用多大的浓度啊？细胞数目怎么样？ 细胞少的话用药浓度就低一点，这个条件自己慢慢摸一下！

xiangchou812

我最近刚做了一下puro的筛选梯度，在山羊成纤维上做的，感觉浓度在0.2－0.4vg/ml之间。

shylook

puro 不过得做下梯度摸好浓度
( s1 Z- Z. {$ [nero不行 细胞很容易产生抗性

jj.jianjia

我用lipofectamine转染fibroblast，用2ug/ml 的puromycin，每次都几乎没有活口。难道是浓度太高了？

hyde

我用5u/ml 的puro杀感觉都有活口的，但细胞长的像薄饼，扩不出来的……（电转的），细胞原来是100万/ml
# X6 `+ W& x3 D% m4 L/ h5 _有些paper用的nero，杀十几天的……
$ h$ b$ N$ c1 W  \+ T求有成功经验者给予指教……

zzc2211

我是做肿瘤，不同细胞对puro的耐受不同，从25ng-500ng/ml都有，首先摸一下耐药浓度，48孔板，倍比稀释，可选加药后7天左右全部死亡的浓度做筛选，同样也是筛选7天左右。也有偷懒的办法，1ug/ml，3-4天或2ug/ml，2天。但个人经验后者不如前者，一筛全死的情况常有，而同样的细胞用第一种方法能够筛出来。理论上讲不过去，但我研究的蛋白就是如此。可能受转染效率，目的蛋白功能，细胞密度等等的影响吧。建议楼主还是摸浓度后再做。有时候偷懒的办法更费事。

zzc2211

另外转染后，细胞传10代，质粒一般没问题。超过此时间就难讲了。如果研究knockdown，理论上用高浓度，短时间的迅速筛选好一些吧。往往理论和实际操作有出入。

jj.jianjia

回复 zzc2211 的帖子+ H+ s% G% b" |. B  P

: G8 r4 {. b! [& U. P我买的puromycin说明书上让尝试1ug-10ug/ml的浓度，3-5天筛选期。
# K  y: D/ ]* I再问个问题：过完筛选期之后是不是就立刻去掉puromycin？多几天时间细胞也是会死的？

hormone008

最好用嘌呤霉素puromycin，效果好于G418，G418要很久细胞才开始大量死亡，假阳性也很多。相反，puromycin就在这两点上好于NEO
$ M' y: x# c7 N抗性！1 t& o3 X" I% ?- c' s( o