综合讨论：脐带间充质干细胞的分离，传代和分化的问题

henryjia

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1 W, d" H4 ^; K. N  S做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了，在此分享一下自己的经验，同时，抛砖引玉，希望大家多提宝贵意见，以完善这个主题研究信息。
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先说细胞分离：比对很对方法后，感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。1 E' k7 K3 B& z5 `0 x
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其次，消化法时掌握不好消化时间，看文献有的说消化过夜，有的说6h的。一直不成功，仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大，不知道添加少量血清是否有保护作用。, l" p" ~5 Y7 i  |1 n

8 c8 K* i$ O$ @培养基：使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基，发现很快（3代左右）细胞老化明显，及时添加bFGF也不能阻止。5 g9 o0 j7 [3 X

( h. ?4 Z5 [% S9 X8 T传代：一直使用0.25%胰酶加EDTA（SIGMA），必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问，这部分细胞是不是干细胞？要还是不要呢？$ `- `8 j% K( [6 T
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多分化潜能的功能测试：这是最头痛的，与骨髓MSC相比，结果简直就是成纤维细胞，根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱，不知道大火的结果如何？真如报道的那么好吗？我怎么做不出来？
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附上我的细胞照片：
( O; k% T$ J  t- p3 ^图1是直接贴壁
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+ m$ X1 a+ L5 v( C# O图2是酶消化0 K+ E" J2 W2 M4 g
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- h3 g: ~$ `2 k. |6 x* h& R" t图3， 是否是平滑肌细胞呢？ 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。) p* [* \: o4 V8 t
感觉当时是有华通胶混杂其中，但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。2 ~7 b  L: d: {# ^# X+ C/ Z) v

农夫有点田

我只做脐带间充质干细胞的分离 没楼主知识面广 但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢？我做的是不超过60分  如果酶是新配的 活性很强的话 就缩短些 个人经验 仅供参考

meister

看上去不错。
4 Z2 K; i- V2 I5 S消化困难的也是干细胞，不过形态扁平，比较老化，诱导分化困难，可以舍弃。

henryjia

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/ c; G" y9 i$ N' [4 B9 B+ x5 H回复 农夫有点田 的帖子* [+ i# X: g* C" G( \+ J# P

& X* B. _( a2 u0 T' j- M7 h1 ^我用的胶原酶都是当天配置的（使用浓度1mg/ml or 2mg/ml，溶解于低糖DMEM中），可是消化效果很慢。 请问您使用什么试剂配置的呢？我的胶原酶I型是SIGMA买的。

zxiaoxiao311

楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗？感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象，主要指的是什么，长得慢？细胞形态有所变化？

liluli0715

我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带，1-3h的消化时间都试过，发现消化时间越长，消化液越粘稠，不容易过滤，需要加大量缓冲液稀释后过滤，离心才能得到细胞。至于细胞形态，觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。

sailree

酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

eggnihao

sailree 发表于 2011-12-2 10:58 / B7 E0 i$ ^' d# Q6 |
酶消化不是好方法，对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化，形态扁平。

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我现在就是遇到这种情况，传代后细胞扁平，出现老化现象，请问你们是怎么解决这种问题的，有没有其他的方法

wind789

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% w" u" P# P/ M+ N; _) T回复 eggnihao 的帖子
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消化完的果冻用大量PBS稀释，只离心清洗一次。" V. t" R" h3 y$ o- D/ G. \6 l
传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化，加入完全培养基，反复轻柔吹打瓶壁。

henryjia

回复 zxiaoxiao311 的帖子0 J- B) Z7 C: U2 F) E+ A, @& h4 a

, h+ \( N7 q- Z! u% C) Z生长慢，形态变化，变大，不规则