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综合讨论:脐带间充质干细胞的分离,传代和分化的问题   [复制链接]

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金话筒 优秀会员 帅哥研究员

楼主
发表于 2011-12-2 08:03 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 08:04 编辑 $ q' [% \; E6 B0 R7 w9 @
* K( i5 S. m& C; s" D& Z
做脐带间充质干细胞的分离有差不多1年了,在此分享一下自己的经验,同时,抛砖引玉,希望大家多提宝贵意见,以完善这个主题研究信息。
/ \# f1 ^1 d, W& n
' {7 P  N2 f6 K+ }3 P# I先说细胞分离:比对很对方法后,感觉I型胶原酶联合透明质酸酶消化最理想。但是仍然个体差异性非常明显。 而且这个方法不能过扩展到脐带动静血管的消化。
1 Q$ d) E2 h5 I% {
. k& I! I1 h9 W9 P! t4 V) r其次,消化法时掌握不好消化时间,看文献有的说消化过夜,有的说6h的。一直不成功,仍然个体差异性非常明显。过夜消化似乎对细胞损害很大,不知道添加少量血清是否有保护作用。# @; G/ m( y0 N8 e% t
$ U% |5 o# b* T% A/ {& N
培养基:使用含10%血清的骨髓MSC相同培养基,发现很快(3代左右)细胞老化明显,及时添加bFGF也不能阻止。/ b# X) P; [; _* j
6 q' S4 _6 X4 f' f0 i) [
传代:一直使用0.25%胰酶加EDTA(SIGMA),必须要用含血清培养基中和。感觉效果还行。同样有不少细胞贴壁很难弄下来。请问,这部分细胞是不是干细胞?要还是不要呢?
( @0 Z2 ?4 |5 D- Q* C0 ?8 {8 G$ N6 y' O- F
多分化潜能的功能测试:这是最头痛的,与骨髓MSC相比,结果简直就是成纤维细胞,根本不像MSC。即使之前FACS表面抗原CD90,CD105, VACAM与MSC很接近。 成脂成骨作用很弱,不知道大火的结果如何?真如报道的那么好吗?我怎么做不出来?& o" G( I  d* E; I* t4 O

( U" R  {- o* J  `附上我的细胞照片:
8 g5 z8 B& j7 r/ @& x" P" E图1是直接贴壁
- U' |& `# T( n4 y  n
& p3 n9 z3 G! a: z* q: R5 k+ E! I8 `: ]3 J& W
图2是酶消化1 y, Y' {2 x3 W+ O! |8 d0 C5 [) X

- b, q; e7 q( W3 K' f$ Z2 e  I# Z, {7 ]( B# _7 n1 I, d  r: w: o
图3, 是否是平滑肌细胞呢? 这是我从期待静脉内层剥离的组织消化培养出来的。1 w' M" c5 W$ h% y, s5 _
感觉当时是有华通胶混杂其中,但是细胞形态均一。很奇怪。最初目的是分离脐静脉平滑肌细胞。
. \. _# s5 u- P
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沙发
发表于 2011-12-2 08:23 |只看该作者
我只做脐带间充质干细胞的分离 没楼主知识面广 但是看了您的胶原酶时间消化6h 是不是太长了呢?我做的是不超过60分  如果酶是新配的 活性很强的话 就缩短些 个人经验 仅供参考
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专家 优秀会员 金话筒

藤椅
发表于 2011-12-2 08:49 |只看该作者
看上去不错。
2 d, Z5 q' C* N) u消化困难的也是干细胞,不过形态扁平,比较老化,诱导分化困难,可以舍弃。
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板凳
发表于 2011-12-2 09:03 |只看该作者
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本帖最后由 henryjia 于 2011-12-2 09:05 编辑
" P- e& R: ~. @1 q7 n6 P9 V2 }- ]; j; K7 a: k) Y# u# S
回复 农夫有点田 的帖子. a/ S1 @. ~+ T) R! ?' D5 |

) p% I2 ^+ q5 J; h我用的胶原酶都是当天配置的(使用浓度1mg/ml or 2mg/ml,溶解于低糖DMEM中),可是消化效果很慢。 请问您使用什么试剂配置的呢?我的胶原酶I型是SIGMA买的。
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报纸
发表于 2011-12-2 09:11 |只看该作者
楼主的图片1和2是在相同倍数下照的吗?感觉酶消化法的细胞要大得多。楼主的细胞三代就开始老化现象,主要指的是什么,长得慢?细胞形态有所变化?
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地板
发表于 2011-12-2 09:25 |只看该作者
我们组织贴壁也做过二型胶原酶消化脐带,1-3h的消化时间都试过,发现消化时间越长,消化液越粘稠,不容易过滤,需要加大量缓冲液稀释后过滤,离心才能得到细胞。至于细胞形态,觉得组织贴壁得到的梭型细胞多。
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发表于 2011-12-2 10:58 |只看该作者
酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
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发表于 2011-12-2 12:36 |只看该作者
sailree 发表于 2011-12-2 10:58
, ?$ i! R% m9 C4 r( T8 c酶消化不是好方法,对细胞质量影响还是很大得出来的细胞容易分化,形态扁平。
5 b- b5 j+ }, C$ `( f
我现在就是遇到这种情况,传代后细胞扁平,出现老化现象,请问你们是怎么解决这种问题的,有没有其他的方法
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发表于 2011-12-2 14:37 |只看该作者
本帖最后由 wind789 于 2011-12-2 14:39 编辑 7 F& ^' U8 V& _( \1 W* K4 [; K/ P8 r

9 R1 R# }, y; s, @0 O" }回复 eggnihao 的帖子
7 T$ q$ }% l8 F) Q! M$ X8 H8 A2 ?" F# t/ n- X
消化完的果冻用大量PBS稀释,只离心清洗一次。2 Y* c1 Y( @- ]/ @
传代的时候镜下细胞稍变圆就立即中止消化,加入完全培养基,反复轻柔吹打瓶壁。
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发表于 2011-12-2 17:09 |只看该作者
回复 zxiaoxiao311 的帖子
) c$ v; D/ b$ f% O! b! q4 ^$ W2 v9 D- e
生长慢,形态变化,变大,不规则
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