求助！免疫组化测肿瘤组织CD133，阳性率太高怎么回事。

胖兜宝贝

我用SANTA CRZU公司的CD133单克隆抗体测的，CD133阳性率20%左右，在阳性的标本里面，无一例外都是高表达强度。, y! q& F6 ]* H. [5 z
按照文献，肿瘤干细胞阳性率应该在1%以下，可是我做出来的阳性病例全是下图这样的，大量表达CD133.
, Z1 Q+ A) H0 n% V7 e: R" U# x3 f# l- ^5 O$ C5 Z1 I( T
请教大家，会是什么原因造成的。

cneagle66

Santa 的抗体阳性率高是出了名的，建议更换抗体试试，比如cellsignal、sigma的，注意不要买到假冒的。

gandanxiaoyang

以前用的是美天旎公司的CD133抗体。
3 X' E. d" s) @; P需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。
6 ?7 N; s! n& S8 P- h而且好像对修复液有特殊要求。看图片好像染色多位于细胞核中，所以染色特异性有待于进一步确定。" G& v9 Q( Z' Y; ]4 W
如果不能肯定，可以先做几张冰冻切片，应该会好很多。

ljs

1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。1 m& U% F# q2 c
2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果有很大的影响
" M5 D% n: g6 q! \5 H1 F3.染色时间是多久？
; {( E8 G! Z3 Z* L4.一抗、二抗的孵育条件是什么、种类属别别搞错。
6 q3 E" G, ?" w6 R4 R/ P8 m1 L总之，综合以上的问题，把各个条件优化到最佳。你的实验仅仅是刚开始，没有优化，出现假阳性有可能。

胖兜宝贝

回复 cneagle66 的帖子+ D& h( ~, G1 h7 J7 u, _* O/ q3 F

# u$ ~/ X: ?0 I. p; p) K实验经费不够了，这个抗体花了2800买的。                                             

胖兜宝贝

8 i2 u$ \1 h4 j% C. y
这是阴性表达的。4 J4 `; o  g; {, e0 S* K9 ]
修复方式是高压修复。' c1 Q6 J' c5 V. _& p! j3 F
染色是用了Elivision plus试剂盒，一抗在37度下孵育1小时，二抗在37度孵育20分钟。

胖兜宝贝

gandanxiaoyang 发表于 2011-12-9 09:24
9 m, Q+ P: J* s0 V9 a' l5 H4 l以前用的是美天旎公司的CD133抗体。
+ q3 g) x: m# R/ @  x  S' v, I需要提醒的是，美天旎公司抗体说明书上说，最好是用冰冻组织的切片做。 ...

* ]# r( u3 Y2 i6 c. C& l是的，基本上都是核染色，按道理是应该胞膜阳性的。但是还有不少阴性的病例。为什么有少数标本表达强度那么高，但是还有很多病例完全没表达呢？

胖兜宝贝

ljs 发表于 2011-12-9 10:07
- W+ o# A9 S" V1.把阴性对照的图片传上来，先看阴性对照。
: C; U4 C/ z0 V0 C4 C# n2.你用的修复方式是什么？不同的修复方式及修复方法对阳性结果 ...

6 N) p- b0 e0 ^) }4 c
我在论坛里看到有人说这种情况可能是抗体浓度过高造成的，请问有这种可能吗？

ljs

抗体浓度过高造成的，有这种可能！！
* S, h  L, m5 j3 d  M* X- |1 @  s8 t实验条件摸索的建议如下
# s) v# X! L, R; M8 q) X1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯度5 d: v& e0 v3 @2 s
2.可以试试不用高压修复，或者减少高压修复时间，看看效果。; ~4 j4 g* l( Y( y, \
3.最后的显色时间、显色液的浓度应该降低。! ^& Y% s* [! e2 R
根据你提供的信息，这个抗体的阳性部位在细胞膜，针对抗体的建议如下：& y  p1 W& z: B/ J; j- b, w
1.更换抗体，从其他的单位找到这个抗体和阳性病理切片，即阳性片，国内很好买到，做着看看，应不成问题，没多少钱。经费不够不是理由，大不了自己掏钱。: e+ M( c6 E! s7 d
2.联系santa售后服务，要他们来解答。

胖兜宝贝

ljs 发表于 2011-12-9 14:53
) A$ E3 _$ S6 l1 e5 M/ }! C2 n抗体浓度过高造成的，有这种可能！！. x" P5 [4 ?8 ]7 S
实验条件摸索的建议如下
- e- n+ {/ ^9 s# h* {9 N% I5 f1.一抗反应条件4度过夜，设置好不同的浓度梯 ...

+ y6 a  P# C; s谢谢，我按照你的建议再试试看