关于碱性磷酸酶染色的讨论

treestem

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!4 J2 y3 f5 y0 i' H& t
目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
7 \: J4 j" H! Y4 K另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？
/ q2 B% v& U1 I4 ?" e3 J0 Y* UPBS洗的时间有影响吗？
1 |$ }- Q9 [9 z. s6 DTBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？
" U5 m7 S" x5 G

luoziwei

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块

南宫燚岚

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

tjbone

偶氮偶联法（Kaplow法）
7 v2 z) ~6 T3 D9 X; V  c原理
$ w" h8 n% u' C5 }3 t+ }4 A中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。! b0 D2 p( [# `; |; a7 Q
结果) u) K# |! T+ ?! m& p
坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。
! |/ S8 h* _: P  m实验方法  S8 i& \% Y3 P2 J
材料：, X* P& `  N0 v! ]8 V0 |" K
1. 10%甲醛甲醇固定液' j$ H/ Y" h, Z/ |4 ]1 }. r
    甲醛     10 ml7 U) @. I: a* w  Y3 h& L
    甲醇     90 ml
# b( D( A, ]) y3 J    20C ~80C避光保存。
) ]- r* A7 s  r% l& M   2. 丙二醇缓冲液2 E  J) A$ U, @
    (1) 贮备液(0.2 mol/L)" _% I, _6 Y) q. K; p
    2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇             10.5 g# B7 B- g# g( n8 q2 w: P
    蒸馏水                              加至500 mL
" L) g; a8 v8 d    溶解后保存冰箱内。$ c% F; }+ n9 `  u, G0 E
    (2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)
5 v) M& V, s( P  u4 N    0.2 mol/L贮存液                      25 mL
. M) y+ c/ K1 ~. q' S* O    0.1 mol/L盐酸                        5 mL
/ w% Y- s8 S3 y+ V. r  F6 a    蒸馏水                              加至100mL
' }( Y% u8 n( i- A  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。. B! O  g, x9 H$ m" ^$ k+ B
    方法：7 `9 {0 y7 e+ n; z3 [
  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。  ^- S7 E) A# h$ K+ u
  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。* C; L0 `$ F( P( t/ d
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。
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