关于碱性磷酸酶染色的讨论

treestem

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!
3 |3 m3 H2 b. r( i9 w目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
+ u! ?; P: e! t  ~5 l4 T* ~另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？
% B/ R) p. p& m3 \PBS洗的时间有影响吗？/ a6 T4 M  j2 l5 A4 }% q
TBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？
( ~/ M3 A. Q7 w* X8 ?- w7 G

tjbone

偶氮偶联法（Kaplow法）3 r( T" I* q1 U  W. a; K
原理
( H' D/ S" k% A' o2 y0 J中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。3 B: B% ~, V$ M- c; u& ^$ @
结果
, k4 |) e" K) G  a6 {坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。
7 Y& d) G" x  |* l实验方法
0 l( q+ r9 K8 c# ]. ^$ T材料：
$ E7 v2 c2 e$ b3 A. W! m1. 10%甲醛甲醇固定液
1 Q0 @# W8 D* }8 Z. Y% R    甲醛     10 ml
5 D( {4 q4 I, q) R8 Z, ^9 y    甲醇     90 ml$ M" h) Q# R$ N
    20C ~80C避光保存。' |: l( w) Z; l$ w  m* I4 O2 s
   2. 丙二醇缓冲液; S) R2 m2 s5 V
    (1) 贮备液(0.2 mol/L)
4 A  |; E2 R) K2 F& ^( N% Q    2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇             10.5 g
! t$ [5 f- X# B1 N/ N$ G) X    蒸馏水                              加至500 mL/ i: M+ j/ i9 y* g
    溶解后保存冰箱内。
+ v( p  t1 t  A    (2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)
5 Z7 q/ Q9 J0 ^: u) I! G6 b3 Y% H/ y    0.2 mol/L贮存液                      25 mL
! h- S4 M. Q: U7 G( F$ Y' [    0.1 mol/L盐酸                        5 mL
8 ]  `! G# [, B6 ~7 N# t( i+ \    蒸馏水                              加至100mL
+ L8 P) W( w7 T( q% F, N3 W7 ?+ e  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。5 g2 V, |0 i0 I% l; B' T. V6 @" r0 x
    方法：( F1 P7 D! @  q8 a
  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。$ c3 {- x* i( @) \5 g" y2 T
  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。+ c$ Z  R3 _+ v8 U
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。) D; F1 T+ s7 ^( X  X- m6 S9 D& v
# d$ f$ ]" e6 Q& k7 D8 e$ R6 v+ E

南宫燚岚

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

luoziwei

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块