关于碱性磷酸酶染色的讨论

treestem

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!( I8 Z  A9 S; l& V0 ~$ c; {( F
目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
; T# k+ B$ n$ d9 w+ l! s另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？2 b1 D; F2 n7 Y+ s; K( ?
PBS洗的时间有影响吗？
5 l: x; B; P% u% y  K5 s1 H5 d5 yTBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？
/ h. W& i1 P- a7 q* E

luoziwei

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块

南宫燚岚

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

tjbone

偶氮偶联法（Kaplow法）; ^& \, ~( }' \+ z7 _6 k
原理
# |2 {% e9 u) \中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。! r$ I  B* _; }8 Z& P+ ]: ~5 W0 D5 @
结果" l9 E, M$ H8 h: w) y& G) _" o
坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。% s) D$ G& o. a2 w
实验方法6 b( w8 I$ @- Z4 ^
材料：1 C3 |: k% n: z2 Q) C# M: R8 o  ?
1. 10%甲醛甲醇固定液
8 g8 g; p4 z1 f8 n! Z    甲醛     10 ml, b0 g. P1 g) m) O
    甲醇     90 ml3 Q7 }, v) G8 k4 d: Y
    20C ~80C避光保存。" e; K7 I* a2 x
   2. 丙二醇缓冲液. r- p4 o; A! ~5 C4 l+ q0 l
    (1) 贮备液(0.2 mol/L)4 l( k# h1 _. Y1 Z
    2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇             10.5 g
8 o" [6 Q) W2 t- [8 M9 q+ C    蒸馏水                              加至500 mL
4 ?1 J6 c7 w3 L' h" `. }+ ?1 L    溶解后保存冰箱内。
/ w6 F; V6 S* P+ |    (2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)% c; ^+ p, j2 j- ^  @% \
    0.2 mol/L贮存液                      25 mL: g2 o. v9 x! o' T6 U  D
    0.1 mol/L盐酸                        5 mL) ?) Y8 k5 J; @& f- ^' K8 ?$ V
    蒸馏水                              加至100mL
6 p; c2 Z: O  @: o: [  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。
% i; s8 O7 n, S, ~  b    方法：% g% g6 ]& z" M0 i' K
  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。
( W. [6 U# v+ o, m' f2 l. w/ D3 P  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。5 K* e* ^! O2 f* G, h. [
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。
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