关于碱性磷酸酶染色的讨论

treestem

刚开始做碱性磷酸酶染色，有几个让我困惑的问题，希望有经验的家人多多指教!
; H% P. ?; f( P- L' i/ b: A目前用的较多的方法是：NBT，但我感觉NBT染出来是蓝色的，而非紫色和红色。哪位知道什么试剂染出来是红的吗？
, y. Z5 N; Z7 H3 X% B  a: W  k另外，为什么有的protocol上说要固定30min，有的说要固定30秒，有的是2min，固定的时间影响很大吗？1 }1 \  D9 M6 I3 o% F
PBS洗的时间有影响吗？' N* H" ^0 ]" j0 V2 L- `
TBST的作用是什么？有的protocol中就没有TBST？* h8 V: V  K# q7 l

tjbone

偶氮偶联法（Kaplow法）
: s6 y, k9 _/ o! m1 X原理8 I; b( a, \+ R" r/ D( ~
中性粒细胞胞浆中的碱性磷酸酶在pH9.2~9.8缓冲液中，能水解磷酸萘酚钠，并释放出磷酸与萘酚。再以重氮盐与萘酚偶联成不溶性有色偶氮染料沉淀于胞浆中。
3 k. N5 {( I8 Q  \9 o结果
! l- R& T: ]+ M5 {$ \& |! L# }坚牢蓝RR阳性为紫黑色颗粒，坚牢紫酱GBC阳性为棕红色沉淀。
. `% S+ V) \& X& A2 n. z+ h实验方法8 |8 _5 Z& Y* [% S
材料：% D$ J9 k: m3 x4 V* y
1. 10%甲醛甲醇固定液9 h  W% H3 l- o/ J$ m
    甲醛     10 ml
& ^8 e1 V" }* n) Z" j    甲醇     90 ml) k: Y/ H4 Q0 b( F, v
    20C ~80C避光保存。
6 r. o- _9 G2 H+ M) S, N   2. 丙二醇缓冲液0 Z4 {) M% }5 c+ v) }
    (1) 贮备液(0.2 mol/L)
+ G# X8 b$ q# r: b+ H  L5 L3 M    2-氨基-2甲基-1，3-丙二醇             10.5 g- Y9 o. D# q. R: P
    蒸馏水                              加至500 mL+ V7 F/ M+ i# l* s6 m
    溶解后保存冰箱内。0 _- M4 B3 {8 [/ L9 Z" ^! G% Y
    (2) 应用液(0.05 mol/L，pH 9.75)1 k3 ]* |9 W" K$ U+ @3 \! \
    0.2 mol/L贮存液                      25 mL
( M0 d% I* ^/ E6 V8 e, K    0.1 mol/L盐酸                        5 mL2 h1 F8 r; a; E2 r
    蒸馏水                              加至100mL
6 B3 N: ]8 E, c, U  3. 基质孵育液(pH9.5-9.6)–磷酸萘酚钠20 mg溶于0.05 mol/L丙二醇缓冲液20 mL，再加坚牢紫酱GBC(或重氮坚牢蓝)20 mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。7 x& z$ z3 p$ J% v
    方法：
$ v) y3 E5 e9 ~5 o. A- |  1．固定  新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定注液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30～60s，待干。) k; A' h- R6 k
  2．显示  把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10～15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。' v# ]& N2 q/ v3 a2 O
  3．复染  置苏木素复染液复染5～8min，蒸馏水冲洗1～2min，待干，镜检。; O1 ?# M# B: V# C- z) Y

% c- `1 E" a4 ~( R! }# Q0 ^

南宫燚岚

染色后的颜色根据你所用的kit而定，有的kit是蓝色，有的kit是红色或棕色，具体说明在购买kit时都有的

luoziwei

南京建成的ALP染色液就行，紫色的，又便宜，才180多块